腹腔注射趨化因子受體2抑制劑RS102895、色甘酸鈉對小鼠間質(zhì)性膀胱炎的預(yù)防觀察

王鑫朋，孫二琳，張東正，趙坤，劉春雨，劉利維

(1 滄州市中心醫(yī)院，河北滄州061001；2 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院)

間質(zhì)性膀胱炎(IC)是指在膀胱鏡下具有典型的膀胱點狀出血、膀胱壁 Hunner 潰瘍及相關(guān)組織學(xué)特征的一種疾病[1]。IC的主要的病理生理變化為肥大細(xì)胞在膀胱黏膜下層及膀胱肌層的活化和聚集[2]。多數(shù)學(xué)者[3]認(rèn)為IC的發(fā)病機(jī)制是“肥大細(xì)胞假說”，但其具體發(fā)生機(jī)制目前尚不明確。肥大細(xì)胞被激活后脫顆?？舍尫沤M胺、5-羥色胺、類胰蛋白酶等多種活性物質(zhì)。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)又稱單核細(xì)胞趨化和激活因子，屬于C-C亞族(β亞族)成員，起初是從人髓樣單核細(xì)胞系THP-1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系以及脂多糖(LPS)或PHA刺激的人外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)。研究[4]發(fā)現(xiàn)，MCP-1對單核細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞有趨化作用，能使嗜堿粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞脫顆粒。趨化因子受體2(CCR2)是肥大細(xì)胞表面MCP-1受體，MCP-1可與CCR2發(fā)生特異性結(jié)合[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，IC患者尿液和膀胱組織中MCP-1的水平和表達(dá)均升高，但具體機(jī)制尚不明確。2016年6月～2017年1月，我們觀察了腹腔注射CCR2抑制劑RS102895、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑色甘酸鈉對小鼠IC的預(yù)防作用?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物、實驗動物、試劑及儀器 趨化因子受體CCR-2抑制劑RS102895購自Tocris公司，肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑色甘酸鈉購自美國Sigma公司。4～6周齡BALB/c雌性小鼠36只，體質(zhì)量17～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，LPS購自美國Sigma公司，硫酸魚精蛋白(PS)購自美國Sigma公司，MCP-1 ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司，組胺ELISA試劑盒購自Abvona公司，酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司。

1.2 小鼠分組、給藥方法 36只雌性BALB/c小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B、C、D組，每組9只。A、B、C組制作小鼠IC模型：0.06 mL/10 g的劑量腹腔注射5%水合氯醛麻醉，麻醉滿意后排空膀胱，繼續(xù)膀胱灌注50 g/L PS(約0.1 mL)，在膀胱內(nèi)保留45 min，再次排空膀胱，生理鹽水沖洗3次，灌注750 μg/mL的 LPS溶液并保留30 min，再次排空膀胱；每隔7天灌注1次，共灌注3次。A組首次膀胱灌注后1.5 h即按照5 mg/kg腹腔注射RS102895，1次/d,共注射21 d；B組首次膀胱灌注前2天即開始腹腔內(nèi)注射色甘酸鈉溶液50 mg/kg，1次/d,共注射23 d；C組每日注射等體積PBS溶液，共注射21 d。D組為空白對照。首次膀胱灌注記為第1 d第5 d使用反射排尿法收集各組小鼠尿液；第22 d拉頸處死各組小鼠，10%甲醛固定膀胱標(biāo)本，備用。

1.3 炎癥指標(biāo)觀察方法

1.3.1 各組膀胱組織黏膜和固有層炎性變化觀察 取各組膀胱組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，隨機(jī)選取5張切片行HE染色。顯微鏡下觀察膀胱組織黏膜和固有層炎性變化。

1.3.2 各組膀胱固有層及逼尿肌中肥大細(xì)胞、脫顆粒細(xì)胞觀察 取各組膀胱組織，石蠟包埋后切片，行甲苯胺藍(lán)染色。隨機(jī)選取甲苯胺藍(lán)染色后的切片中的10個高倍視野，測算各組鏡下肥大細(xì)胞數(shù)、脫顆粒細(xì)胞百分比。

1.3.3 各組尿液MCP-1、組胺水平檢測 收集各組尿液，2 h內(nèi)分別用MCP-1、組胺ELISA試劑盒檢測尿液MCP-1、組胺，所有操作及樣本準(zhǔn)備均嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測量其光密度值 (OD值)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測算各組尿液MCP-1、組胺含量。

2 結(jié)果

2.1 各組膀胱組織炎性變化 C組膀胱炎性反應(yīng)最重，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，膀胱黏膜上皮剝脫并可見組織水腫、充血；A、B組炎性反應(yīng)較輕，膀胱上皮相對完整；D組未見炎性細(xì)胞浸潤，膀胱上皮完整，見圖1。

2.2 各組膀胱固有層及逼尿肌中肥大細(xì)胞計數(shù)、脫顆粒細(xì)胞百分比比較 各組膀胱固有層及逼尿肌中肥大細(xì)胞計數(shù)、脫顆粒細(xì)胞百分比比較見表1。

2.3 各組尿液MCP-1、組胺比較 各組尿液MCP-1、組胺含量比較見表2。

3 討論

圖1 各組小鼠膀胱組織炎性變化(200×)

組別肥大細(xì)胞計數(shù)(個)脫顆粒肥大細(xì)胞百分比(%)A組3.44±1.24*#34.39±4.98*#B組2.78±1.39*#44.73±7.02*#C組16.33±3.57*83.96±6.56*D組1.44±0.8817.28±3.17

注：與D組比較，＊P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

表2 各組尿液MCP-1、組胺含量比較

注：與D組比較，＊P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

IC的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，女性發(fā)病率高于男性，癥狀反復(fù)發(fā)作、診斷困難及治療效果不佳是目前IC的治療難點。目前臨床主要以對癥治療為主[5]。肥大細(xì)胞作為一種重要的炎性細(xì)胞在各種生理病理過程中都發(fā)揮著重要作用，如過敏性哮喘、慢性胃炎、組織的損傷和修復(fù)等。IC的一個主要的病理生理學(xué)變化即為肥大細(xì)胞在膀胱黏膜下層及肌層的活化和聚集。眾所周知，肥大細(xì)胞可以被激活后脫顆粒釋放多種活性物質(zhì)，如組胺、5-羥色胺、類胰蛋白酶、前列腺素、白三烯、血小板活化因子和細(xì)胞因子等[7]，常見的誘發(fā)肥大細(xì)胞激活的因素有細(xì)菌、病毒的某些成分、干擾素等。有研究[8]表明大腸埃希菌屬的LPS 可以誘導(dǎo)肥大細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子、IL-6、IL-13、組胺等。

MCP-1可引起肥大細(xì)胞的聚集和激活，而且可以被單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及某些腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌。MCP-1與CCR2發(fā)生特異性的結(jié)合，此受體主要分布于單核細(xì)胞、髓樣前體細(xì)胞系和嗜堿性粒細(xì)胞中，屬于IL-8R家族[3]。MCP-1通過與相應(yīng)受體結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路， MCP-1活化的信號傳導(dǎo)路徑因細(xì)胞的類型而不同，而路徑的差別又可導(dǎo)致細(xì)胞趨化活性的不同。MCP-1通過與相應(yīng)的受體結(jié)合后發(fā)揮多種生物學(xué)功能。有學(xué)者[9]在IC的動物模型中發(fā)現(xiàn)，IC大鼠的膀胱和尿液中MCP-1蛋白明顯增多，肥大細(xì)胞表面MCP-1受體CCR2表達(dá)增加，并認(rèn)為CCR2受體可能成為一個潛在的IC治療靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，A組小鼠膀胱組織炎性反應(yīng)較輕，膀胱上皮相對完整。

色甘酸鈉作為一種肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑被偶然發(fā)現(xiàn)。它是一種色酮類化合物[10]，對平滑肌無直接松弛作用，對炎性介質(zhì)亦無拮抗作用，主要作用在于抑制抗原抗體結(jié)合后過敏性介質(zhì)的釋放。色甘酸鈉的藥理學(xué)機(jī)制主要是通過與肥大細(xì)胞膜上的鈣離子通道結(jié)合，這樣Ca2+的內(nèi)流受到抑制，從而使MCP-1、組胺、白三烯等多種炎性因子釋放減少[11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，色甘酸鈉可以抑制大鼠肥大細(xì)胞脫顆粒釋放炎性因子。盡管色甘酸鈉的治療效果在患者中有差異性，而且在哮喘的治療中只是起到輔助作用，但是還在諸如肥大細(xì)胞增多癥、過敏性結(jié)膜炎等疾病中有著不錯的治療效果。

雖然目前不能完全解釋肥大細(xì)胞為什么會在IC患者的膀胱中聚集、增殖以及活化脫顆粒，一種可能的解釋是損傷的尿路上皮細(xì)胞或者其他膀胱內(nèi)的細(xì)胞分泌趨化因子如MCP-1。這些趨化因子進(jìn)一步導(dǎo)致肥大的遷移以及活化。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在環(huán)磷酰胺小鼠膀胱炎癥模型中，MCP-1在尿路上皮、固有層以及平滑肌表達(dá)升高，驗證了MCP-1對于肥大細(xì)胞的趨化作用，并且驗證了其對于肥大細(xì)胞的激活。本研究中，A組阻斷CCR2受體后，尿中組胺、MCP-1的含量較對照組明顯下降，因此我們推斷，在尿路上皮出現(xiàn)損傷后，釋放大量的活性因子，結(jié)果引起肥大細(xì)胞的聚集和活化，脫顆粒釋放更多的細(xì)胞因子和炎性因子。這些炎性介質(zhì)進(jìn)一步引起肥大細(xì)胞的聚集和加重膀胱組織的損傷，從而形成惡性循環(huán)。而且在使用肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑色甘酸鈉治療IC小鼠后，有效緩解小鼠膀胱的炎癥水平。

綜上所述，RS102895、色甘酸鈉均可減輕IC模型小鼠的炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與MCP-1通過與肥大細(xì)胞結(jié)合、促進(jìn)組胺釋放有關(guān) 。但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Warren JW, Brown J, Tracy JK, et al. Evidence-based criteria for pain of interstitial cystitis/painful bladder syndrome in women[J]. Urology, 2008,71(3):444-448.

[2] Kolattukudy PE, Niu J. Inflammation, endoplasmic reticulum stress, autophagy, and the monocyte chemoattractant protein-1/CCR2 pathway[J]. Circ Res, 2012,110(1):174-189.

[3] Kang YS, Cha JJ, Hyun YY, et al. Novel C-C chemokine receptor 2 antagonists in metabolic disease: a review of recent developments[J]. Expert Opin Investig Drugs, 2011,20(6):745-756.

[4] Peters KM, Jayabalan N, Bui D, et al. Effect of Sacral Neuromodulation on Outcome Measures and Urine Chemokines in Interstitial Cystitis/Painful Bladder Syndrome Patients[J]. Low Urin Tract Symptoms, 2015,7(2):77-83.

[5] Cox A, Golda N, Nadeau G, et al. CUA guideline: Diagnosis and treatment of interstitial cystitis/bladder pain syndrome[J]. Can Urol Assoc J, 2016,10(5-6):136-155.

[6] Lee T. New insights into the mechanism of the down-regulation of mast cells in the treatment of interstitial cystitis: possible role of siglecs[J]. Int Neurourol J, 2011,15(2):59-60.

[7] Gamper M, Regauer S, Welter J, et al. Are mast cells still good biomarkers for bladder pain syndrome/interstitial cystitis?[J]. J Urol, 2015,193(6):1994-2000.

[8] Palaska I, Gagari E, Theoharides TC. The effects of P. gingivalis and E. coli LPS on the expression of proinflammatory mediators in human mast cells and their relevance to periodontal disease[J]. J Biol Regul Homeost Agents, 2016,30(3):655-664.

[9] Lv J, Huang Y, Zhu S, et al. MCP-1-induced histamine release from mast cells is associated with development of interstitial cystitis/bladder pain syndrome in rat models[J]. Mediators Inflamm, 2012,2012:358184.

[10] Zhang T, Finn DF, Barlow JW, et al. Mast cell stabilisers[J]. Eur J Pharmacol, 2016,778(9):158-168.

[11] Kennedy LL, Hargrove LA, Graf AB, et al. Inhibition of mast cell-derived histamine secretion by cromolyn sodium treatment decreases biliary hyperplasia in cholestatic rodents[J]. Lab Invest, 2014,94(12):1406-1418.

[12] 朱麗波, 林開清, 張信美, 等. 色甘酸鈉對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠肥大細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2015，44(3):278-284.