Ⅱ型人回腸脂肪酸結(jié)合蛋白對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116增殖、遷移的影響及其機(jī)制

張姍姍，張永盟，袁明，趙衛(wèi)星，鮑永華，楊萬(wàn)才

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院)

近年來(lái)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年升高。人回腸脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP6)的mRNA有三種轉(zhuǎn)錄本(transcript 1、2、3)，表達(dá)兩種同工型蛋白，轉(zhuǎn)錄本1和3表達(dá)I型(isoform 1)蛋白，轉(zhuǎn)錄本2表達(dá)II型(isoform 2)蛋白。I型蛋白在肽鏈的N端較2型蛋白多49個(gè)氨基酸，因此，表達(dá)I型的基因又被稱(chēng)為IBABP-L[1]。早期研究[2]并未區(qū)分兩種同工型蛋白，認(rèn)為Ⅱ型FABP6高表達(dá)于結(jié)直腸癌組織中，與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。后續(xù)研究[1]證明在結(jié)直腸癌中顯著高表達(dá)的是I型 FABP6蛋白，并非II型FABP6蛋白，Ⅰ型FABP6可通過(guò)調(diào)控NF-κB通路參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。Ⅱ型FABP6可調(diào)控FXR受體參與膽汁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收和肝腸循環(huán)[3，4]。但Ⅱ型FABP6蛋白在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制目前并不清楚。我們觀察了Ⅱ型人回腸脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP6)對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116增殖和遷移的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 HCT116(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所)；FABP6 transcript2 引物(上海生工生物工程有限公司合成)；DH-5α感受態(tài)(Takara公司)；pEGFP-N1載體；BCA 蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；CCK8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Transwell小室(Corning公司)；瓊脂糖膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司合成)；DNA提取試劑盒(Omega公司)；FABP6 抗體(Abcam 公司)；STAT3抗體、p-STAT3抗體、AKT抗體(Proteintech公司)；CyclinD1抗體(Abcam公司)；p-CyclinD1抗體(Abcam公司)E-cadherin抗體(Abcam公司)；N-cadherin抗體(Abcam公司)；GAPDH抗體(Abcam)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 Ⅱ型FABP6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-FABP6構(gòu)建 利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)能夠特異性擴(kuò)增FABP6-Ⅱ型轉(zhuǎn)錄本的引物，并經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)，由上海生工生物工程有限公司合成，引物如下：FABP6基因(NM_001445)(上游引物：5′-ATGGCTTTCACCGGCAAGT-3′；下游引物：5′-GAGGCCAGTCTCTTGCT-3′)，片段大小386 bp，限制性核酸內(nèi)切酶EcoR1/BamH1。培養(yǎng)HCT116細(xì)胞，用TRIzol提取細(xì)胞總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，用上述引物進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收，將回收片段和帶有熒光標(biāo)記的空載體pEGFP-N1用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR1/BamH1進(jìn)行雙酶切，兩者酶切后的產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶37 ℃連接，連接后的產(chǎn)物即為帶有熒光標(biāo)記的Ⅱ型FABP6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒即pEGFP-FABP6，相對(duì)應(yīng)的空載體作為對(duì)照質(zhì)粒即pEGFP-N1。分別將兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞DH-5α中進(jìn)行擴(kuò)增，按照DH-5α說(shuō)明書(shū)操作，然后用DNA提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-FABP6經(jīng)上海生工測(cè)序鑒定，與Ⅱ型FABP6基因堿基序列比對(duì)之后，結(jié)果正確。

1.3 細(xì)胞分組及pEGFP-FABP6轉(zhuǎn)染 用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HCT116細(xì)胞，培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2，培養(yǎng)箱相對(duì)濕度95%。選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞傳代時(shí)用0.25%胰酶消化，均勻的接種到6孔板和96孔板中，備用。將細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，用Lipofectamine3000 轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染pEGFP-FABP6、pEGFP-N1。所有操作均嚴(yán)格按照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用倒置熒光顯微鏡觀察熒光蛋白GFP的表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率在80%左右，證明轉(zhuǎn)染成功。

1.4 細(xì)胞增殖情況觀察 采用CCK-8法。取兩組細(xì)胞，種植于96孔板中，5 000/孔，每組5個(gè)復(fù)孔。分別于轉(zhuǎn)染0、24 、48 h每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定在450 nm處的吸光度OD值。以O(shè)D值代表細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞遷移情況觀察 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染12 h取兩組細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞，各取2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞鋪到小室中，上室中加入200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，24孔板下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h取出小室，4%多聚甲醛固定30 min，DAPI染色30 min，PBS清洗3遍，用棉棒將小室內(nèi)的細(xì)胞擦拭干凈，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野拍照，測(cè)算兩組穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 兩組細(xì)胞STAT3、p-STAT3、AKT、CyclinD1、p-CyclinD1、N-cadherin、E-cadherin蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染48 h取兩組細(xì)胞，RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，14 000 g/min離心20 min,吸取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。統(tǒng)一濃度后加入蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min。所有操作均嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。ECL顯影劑顯影，拍照。采用Image J 軟件進(jìn)行條帶灰度處理，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞OD值比較 轉(zhuǎn)染0、24 、48 h兩組細(xì)胞OD值比較見(jiàn)表1。

表1 不同轉(zhuǎn)染時(shí)間兩組細(xì)胞OD值比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.2 兩組穿膜細(xì)胞數(shù)比較 轉(zhuǎn)染36 h時(shí)后觀察組和對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(30.0±5.0)、(64.7±10.0 )個(gè)，二者比較，P<0.05。

2.3 兩組細(xì)胞STAT3、p-STAT3、AKT、CyclinD1、p-CyclinD1、N-cadherin、E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)表2。

表2 兩組細(xì)胞STAT3、p-STAT3、AKT、CyclinD1、p-CyclinD1、N-cadherin、E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

研究[5，6]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌的發(fā)生跟膽汁酸特別是次級(jí)膽汁酸有關(guān)，膽汁酸的增多可以使正常腸道黏膜上皮損傷、凋亡，進(jìn)而發(fā)生基因突變，導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生，而FABP6參與膽汁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、消化、吸收和肝腸循環(huán)。已有研究[1]證明，F(xiàn)ABP6在結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著升高，但只是其中的Ⅰ型FABP6上調(diào)，才導(dǎo)致總FABP6升高，而Ⅱ型FABP6在結(jié)腸癌中的表達(dá)并未升高，因此猜測(cè)Ⅱ型FABP6是否另有作用。

Ⅱ型FABP6受FXR途徑調(diào)控，F(xiàn)XR與Ⅱ型FABP6協(xié)同調(diào)節(jié)腸道膽汁酸的平衡。FXR 的激活可以上調(diào)Ⅱ型FABP6 的表達(dá)[7]，Ⅱ型FABP6與膽汁酸結(jié)合，有助于膽汁酸的肝腸循環(huán)，從而降低膽汁酸在腸道的濃度以抑制其對(duì)腸道上皮細(xì)胞的毒性。已有研究[8，9]證明，F(xiàn)XR在結(jié)腸癌中低表達(dá)，并且抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此猜測(cè)Ⅱ型FABP6是否也有抑制結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的作用。

眾所周知，許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由慢性炎癥介導(dǎo)的，慢性結(jié)腸炎亦是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，而STAT3則是介導(dǎo)結(jié)腸炎和結(jié)腸癌及炎癥與炎癥之間最重要的關(guān)鍵點(diǎn)，許多的炎癥因子、信號(hào)分子及其他的信號(hào)通路都能夠激活STAT3信號(hào)通路，STAT3能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]，本研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型FABP6能夠抑制STAT3的活化。AKT是大多數(shù)組織中表達(dá)的一種常見(jiàn)致癌基因[11]，PI3K/AKT信號(hào)途徑是與癌癥發(fā)展和進(jìn)展相關(guān)的最常見(jiàn)的失調(diào)信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一[12～15]。已有研究[16]證明，AKT信號(hào)途徑的活化可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，而在本研究中發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞中Ⅱ型FABP6能夠下調(diào)AKT的表達(dá)。

E-cadherin的低表達(dá)或者不表達(dá)和N-cadherin的異常表達(dá)是很多惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[17]。在結(jié)腸癌中，隨著腫瘤惡性程度的發(fā)展，E-cadherin逐漸向N-cadherin轉(zhuǎn)化，當(dāng)新的轉(zhuǎn)移灶形成后，E-Cadherin再次表達(dá)[18，19]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組E-cadherin蛋白表達(dá)增加，N-cadherin蛋白表達(dá)減少，提示Ⅱ型FABP6蛋白能夠通過(guò)影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的途徑而促進(jìn)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。該結(jié)果提示，Ⅱ型FABP6蛋白能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，其可能的機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3/AKT信號(hào)通路，還可能通過(guò)EMT途徑影響結(jié)腸癌的遷移和轉(zhuǎn)移，然而其影響上述蛋白的表達(dá)是由其自身調(diào)控還是通過(guò)和其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物發(fā)揮作用尚不清楚。膽汁酸特別是次級(jí)膽汁酸能夠誘導(dǎo)大腸癌的發(fā)生發(fā)展，已經(jīng)是大腸癌發(fā)生的一個(gè)高危因素[20]，而FABP6蛋白是腸道內(nèi)唯一能夠直接結(jié)合膽汁酸而參與膽汁酸代謝的蛋白，其研究有望能夠?yàn)榕R床上膽汁酸所誘導(dǎo)的大腸癌提供早起診斷和治療的途徑。

綜上所述，Ⅱ型FABP6可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移，可能與其抑制STAT3、p-STAT3、AKT、CyclinD1、p-CyclinD1、N-cadherin表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)有關(guān)。

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