Tandab(CD3/CD19)與CD19+、CD3+血液病細(xì)胞結(jié)合力及對PBMC的CD19+血液病細(xì)胞殺傷力觀察

魏中琴，張曉龍，楊圓圓，盧楊，林芳珍，張硯君

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院，天津300020)

化學(xué)療法、放射療法或兩者聯(lián)用是腫瘤治療的傳統(tǒng)方法，但治療腫瘤的效果不佳?？贵w治療是一種新興的腫瘤治療方法，可有效提高治療效果，且毒副作用小。但傳統(tǒng)的單克隆抗體無法有效募集T細(xì)胞至腫瘤部位，從而影響治療效果。隨著分子生物學(xué)和基因工程的發(fā)展，一些能募集T細(xì)胞的雙特異性抗體(BsAbs)的出現(xiàn)解決了這一問題[1]。目前已被美國FDA批準(zhǔn)用于前B細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病(B-ALL)的雙特異性T細(xì)胞銜接子(BiTE)[2，3]是這一領(lǐng)域最有前景的BsAbs。但BsAbs半衰期很短，治療時需長時間給藥。Kipriyanov等首次設(shè)計了一種對CD3和CD19都具有兩個結(jié)合位點的串聯(lián)四價雙特異性抗體(Tandab)，分子量為105 kDa(約為BiTE的兩倍), 在體內(nèi)不容易被腎臟清除；且在體內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。體內(nèi)研究[4]表明，Tandab在靜脈注入小鼠體內(nèi)后的半衰期為18.4～22.9 h。我們觀察了Tandab(CD3/CD19)與CD19+、CD3+血液病細(xì)胞結(jié)合力及其對外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的CD19+血液病細(xì)胞殺傷力的影響。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 抗體、細(xì)胞、及試劑 Alexa Fluor 488標(biāo)記的鼠源性抗His-tag單克隆抗體購自MBL公司；PE標(biāo)記抗CD3單克隆抗體(HIT3a)及FITC標(biāo)記抗CD19單克隆抗體(HIT19a)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所科技公司。人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Raji、BJAB、Daudi(CD19+)，人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat(CD3+)及人慢性髓系白血病細(xì)胞系K562(CD19-和CD3-雙陰性)由本室保存；人胚腎293T細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所國家重點實驗室程濤教授饋贈。載體pAYZ-CD3CD19由本室構(gòu)建并保存；載體pGL3-Control (Promega)由本室保存；慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所國家重點實驗室馬曉彤教授饋贈，是慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP去掉CMV啟動子后得到的pCDH-MCS-EF1-copGFP(pLentiR-EV)，表達(dá)載體中含有編碼綠色熒光蛋白的基因，便于在轉(zhuǎn)染時觀察轉(zhuǎn)染效率。正常人外周血由天津市血液中心提供；Taq DNA聚合酶購自上海申能博彩生物公司；Pyrobest DNA聚合酶購自TAKARA公司；T4 DNA連接酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；ECL蛋白免疫印跡底物液(A和B)、BCA蛋白定量試劑盒，購自美國Pierce公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；DNA片段膠回收試劑盒購自大連寶生物TAKARA公司；超濾管購于美國Milipore公司；HisTrap excel蛋白純化柱購自美國GE公司；His-Tag ELISA檢測試劑盒購自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2 慢病毒表達(dá)載體pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)的構(gòu)建、純化及鑒定 采用PCR、overlap PCR、酶切、連接等方法構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)。以pAYZ-CD3CD19為模板,將CD3VL-CD19VH和CD19VL-CD3VH序列擴(kuò)增，將兩個單鏈抗體的可變區(qū)通過不同長度的G4S序列連接在一起并克隆進(jìn)載體中，同時在多肽鏈的羰基端引入6個His標(biāo)簽，得到編碼Tandab(CD3/CD19)的基因片段，多肽鏈表達(dá)后會以首尾相連的形式形成同源二聚體?？寺∪雙GL3-Control載體，將SV40啟動子、目的基因、PolyA片段和SV40增強子克隆到pCDH-MCS-EF1-copGFP中，得到表達(dá)載體pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)。將Lipofectamine 2000與稀釋后的pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)混合，均勻加入293T細(xì)胞培養(yǎng)液中混勻，使pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。48 h后收集上清，離心去除細(xì)胞殘渣。根據(jù)HisTrap Excel(1 mL)親和鎳柱的操作說明對攜帶His標(biāo)簽的目的蛋白Tandab(CD3/CD19)于AKTA Primer純化系統(tǒng)中進(jìn)行純化。BCA蛋白分析法測得 Tandab(CD3/CD19)的抗體濃縮后可達(dá)20 μg/mL。將樣品(分為兩組，其中一組加入終濃度為2%的巰基乙醇)與上樣緩沖液混勻，煮沸10 min。12%SDS-PAGE后考馬斯亮藍(lán)染色，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入小鼠抗His 標(biāo)簽單克隆抗體4 ℃孵育過夜，用PBST洗滌3次，每次10 min。將NC膜與用脫脂奶封閉液稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體(1∶5 000稀釋)密封在塑料袋中，置于搖床中于室溫孵育2 h。用PBST洗滌3次，每次10 min，于化學(xué)發(fā)光成像分析儀中顯色,觀察到存在CD3(106 kDa)、CD19(53 kDa)條帶，同時由于分子間的相互作用力，有部分產(chǎn)物的存在形式是四聚體。

1.3 Tandab(CD3/CD19)與)與CD19+、CD3+血液病細(xì)胞的結(jié)合力觀察

1.3.1 Tandab(CD3/CD19)與CD19+、CD3+血液病細(xì)胞的直接結(jié)合力 采用FACS法。將終濃度為5 pmol/mL的純化Tandab(CD3/CD19)分別加入到1×106靶細(xì)胞(Raji、Daudi、BJAB、Jurkat和K562)中，孵育1 h，冷PBS洗滌3次。加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗His-tag抗體(終濃度為0.5 μg/mL)孵育30 min。冷PBS洗滌細(xì)胞2次。將細(xì)胞沉淀重懸于500 μL PBS。流式細(xì)胞分析儀(LSRII)中觀察Tandab(CD3/CD19)與相應(yīng)靶細(xì)胞的直接結(jié)合力(出現(xiàn)與陰性對照不重合的曲線即視為具有結(jié)合力)。

1.3.2 Tandab(CD3/CD19)和HIT19a(或HIT3a)對CD19+、CD3+細(xì)胞的競爭結(jié)合力 采用FACS法。

將終濃度為5 pmol/mL的純化Tandab(CD3/CD19)加入到1×106細(xì)胞(Raji、Daudi、BJAB和Jurkat)中，共同孵育1 h，冷PBS洗滌3次。將細(xì)胞分為兩組，分別加入FITC標(biāo)記的HIT19a或PE標(biāo)記的HIT3a。4 ℃下共同孵育30 min，冷PBS洗滌細(xì)胞2次。將細(xì)胞沉淀重懸，流式細(xì)胞分析儀中測定Tandab(CD3/CD19)和HIT19a(或HIT3a)與靶細(xì)胞的競爭結(jié)合力(判定方法同上)。

1.4 Tandab(CD3/CD19)對PBMC的CD19+血液病細(xì)胞殺傷力影響檢測方法 采用乳酸脫氫酶釋放法。將Raji、Daudi、BJAB和K562細(xì)胞分為三組，96孔板中鋪入1×105個，按照效靶比E∶T=20∶1加入PBMC(IL-2刺激72 h)，分別加入終濃度為8、0.8、0.08 pmol/mL的Tandab(CD3/CD19)。采用CytoTox 96非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Promega)，同時設(shè)置靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔、效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔、靶細(xì)胞最大釋放孔、體積校正對照孔及培養(yǎng)基背景對照孔，實驗孔和對照孔至少設(shè)置三個復(fù)孔。充分混勻后37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)8 h。靶細(xì)胞最大釋放孔及體積校正對照孔在收集上清前45 min分別加入20 μL Lysis Solution。離心后從每孔吸50 μL上清至一個新的96孔平底板中。每孔加入配制好的底物液，室溫避光孵育。30 min后每孔中加入50 μL Stop Solution。1 h內(nèi)于490 nm處測量各孔的光密度OD值，計算各濃度者PBMC的細(xì)胞毒性百分比。細(xì)胞毒性百分比=(OD值試驗孔-OD值效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔-OD值靶細(xì)胞自發(fā)孔)/(OD值靶細(xì)胞最大孔-OD值靶細(xì)胞自發(fā)孔)×100%。

2 結(jié)果

Tandab(CD3/CD19)與Raji、Daudi、BJAB、Jurkat均出現(xiàn)與陰性對照不重合的曲線，即Tandab(CD3/CD19)可與Raji、Daudi、BJAB、Jurkat細(xì)胞結(jié)合，具有直接結(jié)合力。Tandab(CD3/CD19)可阻止單克隆抗體(HIT19a或HIT3a)與Raji、Daudi、BJAB、Jurkat細(xì)胞的結(jié)合，具有競爭結(jié)合力。

加入不同濃度Tandab(CD3/CD19)后PBMC細(xì)胞對Raji、Daudi、BJAB、K562細(xì)胞毒性百分比比較見表1。

表1 加入不同濃度Tandab(CD3/CD19)后PBMC細(xì)胞對四種細(xì)胞毒性百分比比較

注：與同種細(xì)胞前一濃度比較，*P<0.05。

3 討論

目前，各種惡性腫瘤的治療主要依靠化療藥物治療，放療減小病灶，手術(shù)切除等方式。靶向藥的應(yīng)用就能很好的避免化療藥應(yīng)用帶來的骨髓移植等不良反應(yīng)，比如利妥昔單抗(美羅華)在國內(nèi)的應(yīng)用越來越普遍，而且沒有傳統(tǒng)化療藥的副作用，但價格較高?？贵w治療同樣也具有靶向作用，在提高親和常數(shù)的同時，延長在體內(nèi)的作用時間，降低副作用等方面，依然有很大的應(yīng)用前景。相對于以二聚體形式存在的全抗，片段抗體如Fab、ScFv等通常會有結(jié)合活性弱以及半衰期短的問題[5，6]，影響了其實際應(yīng)用。抗體二聚化具有能夠快速聚集到腫瘤處，有效清除腫瘤細(xì)胞等的優(yōu)點[7]，促進(jìn)了其發(fā)展。

在前期研究中，我們課題組曾試圖在片段抗體Fab重鏈的羧基端形成二硫鍵形成F(ab′)2，得到的抗體二聚化比率較低，抗體親和力也沒很大提高[8,9～13]。本研究通過引入二硫鍵，來形成同源二聚體，增加抗體二聚化程度以及提高了抗體親和力。眾所周知，能有效募集T細(xì)胞是殺傷腫瘤細(xì)胞非常重要的環(huán)節(jié)。至今，主要有兩種方法將其募集到腫瘤部位，第一種是通過嵌合抗原受體(CAR)修飾T細(xì)胞。為了進(jìn)一步改良CAR的設(shè)計，甚至在CAR中不斷引入共刺激因子如CD28、4-1BB或OX40[14]。第二種是由雙特異性抗體(BsAbs)[15]介導(dǎo)來募集T細(xì)胞到腫瘤部位。這種抗體一端可以和T細(xì)胞結(jié)合，另一端可以和與腫瘤有關(guān)的抗原表位結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。在這一點，本實驗室曾構(gòu)建并表達(dá)過這種雙特異性抗體(antiCD19/antiCD3 diabody)，能有效募集T細(xì)胞而有效殺傷CD19陽性的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞和病人來源的B-ALL細(xì)胞[5,16]。

本研究中，我們根據(jù)antiCD19/antiCD3 diabody的序列成功構(gòu)建了一種串聯(lián)四價雙特異性抗體Tandab(CD3/CD19)。這種抗體與CD3抗原和CD19抗原分別具有兩個結(jié)合位點。其形成的相對量由多肽鏈中間Linker的長度決定。有研究[8]表明，過短或過長的Linker都對TandAb 的形成不利。所以我們選擇了長度為15個氨基酸殘基的序列(3個重復(fù)的G4S序列)作為中間連接。本實驗室之前的一些研究表明在VH3和VL3適當(dāng)位置引入半胱氨酸來形成二硫鍵可以提高融合蛋白的穩(wěn)定性[5,10]在本課題中也有所應(yīng)用。

綜上所述，Tandab(CD3/CD19)與CD19+、CD3+血液病細(xì)胞具有直接結(jié)合力和競爭結(jié)合力，并可促進(jìn)PBMC對CD19+血液病細(xì)胞的殺傷力。這為后期在體內(nèi)進(jìn)一步驗證該四價抗體對CD19+腫瘤細(xì)胞的抑制作用，為抗體靶向治療的研究提供了理論依據(jù)。

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