薯蕷皂苷元對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞株增殖、侵襲、遷移影響及機(jī)制

尹靜,邵雪齋,李淑靜,于春燕,郭亞春,邢恩鴻,趙鑫

(1承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；3承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院4石家莊第六醫(yī)院)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是漿細(xì)胞來源惡性增生血液性疾病，主要臨床表現(xiàn)為骨痛、免疫力下降、貧血、腎功能不全等[1]，MM多見中老年男性,發(fā)病率占血液系統(tǒng)惡性腫瘤10%～15%，占惡性腫瘤1%～2%[2]。目前發(fā)病率已超過急性白血病，僅次于非霍奇淋巴瘤，位于血液系統(tǒng)腫瘤第二位[3]。MM臨床發(fā)病率增加與MM的遷移、侵襲有關(guān)。MM基質(zhì)細(xì)胞能分泌促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、IL-8、IL-12等，促進(jìn)MM遷移、侵襲。硼替佐米(BTZ)[4]是常用臨床治療MM藥物，初發(fā)患者治療效果較佳，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移患者出現(xiàn)耐藥、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移較多，效果不佳。薯蕷皂苷元(Dio)是薯蕷皂苷水解產(chǎn)物，屬于甾體皂苷元，廣泛存在薯蕷、百合、石竹等植物中[5]。具有抗炎[6～8]、抗腫瘤[9～10]、調(diào)節(jié)免疫[11～13]等功效。研究[14]發(fā)現(xiàn)，Dio對(duì)白血病、肝癌、宮頸癌、胃癌、小細(xì)胞肺癌等腫瘤的增殖、血管新生、凋亡均有一定作用，但Dio對(duì)MM患者治療作用目前尚未報(bào)道。2016年4月～2017年4月，我們通過實(shí)驗(yàn)觀察薯蕷皂苷元(Dio)對(duì)人MMRPMI8226細(xì)胞增殖、遷移及侵襲影響，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器 MM細(xì)胞株(RPMI8226)為承德附屬醫(yī)院血液科饋贈(zèng)；含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素培養(yǎng)RPMI8226細(xì)胞，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱于2～3天換液，以900 r/min5 min后收取沉淀細(xì)胞，重懸后分2皿繼續(xù)培養(yǎng)。按7：2∶1的RPMI1640:胎牛血清:二甲基亞砜按配制凍存液，每管凍存1×106細(xì)胞，放入1.5 mL凍存液凍存?zhèn)溆?。薯蕷皂苷?Diosgenin，Dio)美國(guó)Sigma公司；噻唑藍(lán)(MP Biomedical)；RPMI1640(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(天津康源)；青霉素-鏈霉素(美國(guó)Hyclone公司);Tranwell小室(BD公司)；Matrigel Basement Membrane Matrix);ECMgel 基質(zhì)(BD公司)；二甲基亞砜(thermo公司)；IL-8humanELISA(thermo公司)；VEGF、IL-6humanELISA(武漢華美有限公司)。 高速低溫離心機(jī)(丹麥Labogene公司)、酶標(biāo)儀(加拿大Biotek公司)；CSR-1-30型純水機(jī)(中國(guó)北京愛斯泰克公司)；倒置顯微鏡(中國(guó)Motic公司)。

1.2 Dio對(duì)RPMI8226細(xì)胞增殖影響 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RPMI8226細(xì)胞分1、2、3、4、5組，900 r/min離心5 min，調(diào)整終濃度細(xì)胞數(shù)為2×105/L，種96孔板(100 μL/孔)，將細(xì)胞分實(shí)驗(yàn)組(1、2、3、4、組)和5組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。1、2、3、4組分別加入終濃度為 10、20、30、40 μmol/L的Dio，5組置于單純完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不做任何處理。分別于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h，終止培養(yǎng)，每孔加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，以2 000 r/min離心5 min，留取底部細(xì)胞，加入100 μL/孔二甲基亞砜，在490 nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀中，震蕩10 min，檢測(cè)各孔光密度值(OD值)。參考文獻(xiàn)[15]計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)，選取高、中、低Dio濃度為40、30、20 μmol/L及最佳作用時(shí)間為48 h。

1.3 Dio對(duì)RPMI8226細(xì)胞遷移、侵襲能力影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RPMI8226細(xì)胞，900 r/min離心5min，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞終濃度2×105/L，將細(xì)胞分高、中、低Dio組、BTZ組、對(duì)照組，每組設(shè)8 mL。高、中、低濃度分別加入16、12、8 μL Dio原液，BTZ組BTZ濃度參考文獻(xiàn)[16],最終設(shè)定濃度為10 nmol/L。對(duì)照組不做任何處理，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。1 500 g/min離心15 min，收集上清。放入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 各組細(xì)胞遷移力的觀察，采用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。收集各組細(xì)胞,Transwell 上室中加入 200 μL 細(xì)胞懸液。充分混勻。將高、中、低濃度組、對(duì)照組、BTZ組，分別放入下室。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，終止后收集下室溶液，1 500 r/min、5 min離心，收集細(xì)胞沉淀，用20 μL完全培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)。每組2個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2 各組細(xì)胞侵襲能力觀察 采用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。收集各組細(xì)胞，ECMgel 基質(zhì)膠置于4 ℃過夜，EP管、 Tip 頭、24孔培養(yǎng)板、Tranwell小室等均置于-20 ℃冰箱預(yù)冷30 min。將融化后 ECMgel 基質(zhì)膠按1∶3比例與RPMI1640混勻后，Transwell 上室加入稀釋后ECMgel 基質(zhì)膠，每孔50 μL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，調(diào)整RPMI8226細(xì)胞終濃度2×105/mL置于上室。加入600 μL于下室，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，終止后收集下室溶液，1 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，用20 μL完全培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)各組細(xì)胞侵襲數(shù)量。每組2個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 各組細(xì)胞上清IL-6、VEGF、IL-8蛋白檢測(cè) 采用ELISA法。VEGF、IL-6、IL-8檢測(cè)參照試劑盒說明，配不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品濃度設(shè)2 000、1 000、500,250、125、62.5、31.25、0 pg/mL，取各組樣本上清置于室溫10 min，1 000 g/min離心5min，將樣本、標(biāo)準(zhǔn)品100 μL置于小室中。覆蓋酶標(biāo)板貼，常溫孵育2 h。加入生物素標(biāo)記抗體100 μL，敷板貼，37 ℃孵育1 h。洗3次，甩干。再加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體，敷板貼，37 ℃孵育1 h，洗5次甩干，每孔加入90 μL底物溶液，4 min室溫，加入50 μL終止液，立即在450 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀震板30 s后檢測(cè)各孔光密度值(OD值)。根據(jù)樣品吸光值在坐標(biāo)上找出樣本濃度，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，各組重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞OD值比較 不同培養(yǎng)時(shí)間各組細(xì)胞OD值比較見表1。隨培養(yǎng)時(shí)間增加，1、2、3、4組細(xì)胞OD值增加(P均<0.05)；隨作用濃度增加，細(xì)胞OD值增加(P均<0.05)。

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間各組細(xì)胞OD值

2.2 各組細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)比較培養(yǎng)48 h各組細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)比較見表2。

表2 培養(yǎng)48 h各組細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)比較

注：對(duì)照組比較，*P<0.05 ;與 BTZ組比較，ΔP<0.05。

2.3 各組上清液IL-6、VEGF、IL-8相對(duì)表達(dá)量比較 培養(yǎng)48 h各組上清液IL-6、VEGF、IL-8相對(duì)表達(dá)量比較見表3。

表3 培養(yǎng)48 h各組上清液IL-6、VEGF、IL-8相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與BTZ組比較，ΔP<0.05 。

3 討論

MM是漿細(xì)胞來源的B細(xì)胞惡性增殖性腫瘤，發(fā)病率位居惡性血液系統(tǒng)腫瘤第二位[17]。MM細(xì)胞和骨髓瘤基質(zhì)細(xì)胞都分泌IL-6,IL-6與MM細(xì)胞增生、凋亡密切相關(guān)，MM微環(huán)境中IL-6可以刺激MM細(xì)胞增殖，同時(shí)，MM可以通過自分泌和旁分泌IL-6。VEGF可以刺激MM旁分泌IL-6,IL-6又可以促進(jìn)VEGF的產(chǎn)生，二者存在一定相關(guān)性。研究[18]表明，IL-8為炎性趨化因子，中心粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、多種腫瘤細(xì)胞都可以分泌IL-8，MM患者的骨髓基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞可產(chǎn)生IL-8。MM復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與MM侵襲力、血管新生、黏附能力強(qiáng)有關(guān)。其因子有腫瘤壞死因子(TNF)、IL-10[19]、IL-17、IL-4、IL-2、VEGF、IL-6、IL-8、血漿單核細(xì)胞趨化因子-1(MCF-1)因子有關(guān)。VEGF是促進(jìn)血管新生的主要因子，在惡性血液系統(tǒng)疾病中起著重要的作用，VEGF增加血管通透性，促進(jìn)血液中蛋白滲出，是腫瘤基質(zhì)中新生毛細(xì)血管形成的基礎(chǔ)；VEGF可激活蛋白酶，降解基底膜，有利于內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。VEGF還為腫瘤的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)并帶走代謝過程中廢物。IL-8可增加破骨及溶骨性，刺激外周血細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為破骨細(xì)胞，進(jìn)一步造成骨損傷，惡性期MM比穩(wěn)定期MM骨髓中IL-8的表達(dá)量高，IL-8和IL-6的分泌量存在相關(guān)性，IL-8可誘導(dǎo)MM細(xì)胞增殖及趨化，促進(jìn)血管新生，故MM侵襲、遷移和IL-8有相關(guān)性。目前，MM臨床用藥主要為BTZ[20,21]，BTZ可促進(jìn)MM的凋亡、抑制其增殖，通過抑制MM骨髓基質(zhì)、MM分泌IL-6，抑制其增殖，減弱侵襲、遷移能力。

MM患者復(fù)發(fā)率高，這與血管新生有著密切關(guān)系。MM目前尚無有效治療方法，如何提高復(fù)發(fā)MM患者的生存期，是目前學(xué)術(shù)界需要解決的問題。研究表明，Dio能夠能抑制實(shí)體腫瘤血管新生[22,23]，增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)活性，減少腫瘤細(xì)胞的黏附作用，對(duì)于抑制實(shí)體腫瘤血管新生有一定效果。同時(shí)，Dio還具有較小毒副作用。

本研究用不同濃度Dio作用于RPMI8226細(xì)胞不同時(shí)間，觀察到Dio可以抑制RPMI8226細(xì)胞增殖，增殖抑制能力與藥物濃度、作用時(shí)間成正比。與對(duì)照組比較，BTZ組、高、中、低Dio濃度遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)減少;與BTZ組比較，高、中、低組Dio濃度遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)減少。與對(duì)照組比較，其余各組IL-6、VEGF、IL-8上清中蛋白相對(duì)表達(dá)量減少;與BTZ 組比較，高、中、低Dio濃度IL-6、VEGF、IL-8的表達(dá)量減少。Dio可以明顯降低上清中VEGF、IL-6、IL-8 表達(dá)量，同時(shí)，通過減少VEGF、IL-6、IL-8的分泌，減少血管新生。

綜上所述，Dio能夠抑制RPMI8226細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲。其機(jī)制可能與其下調(diào)細(xì)胞IL-6、VEGF、IL-8的表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)血液科醫(yī)師分會(huì). 中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2015年修訂)[J]. 中華內(nèi)科雜志, 2015, 54(12):1066-1070.

[2] 孫穎,王慧涵,楊威.多發(fā)性骨髓瘤2015年NCCN指南更新及解讀[J].實(shí)用藥物與臨床,2015,18(8):881-885.

[3] 翁翔, 顧超, 翟麗娜,等. 硼替佐米在多發(fā)性骨髓瘤治療中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)腫瘤, 2014, 23(8):674-679.

[4]Jakubowiak A, Offidani M, Pégourie B, et al. Randomized phase 2 study of elotuzumab plus bortezomib/dexamethasone (Bd) versus Bd for relapsed/refractory multiple myeloma[J]. Blood, 2016, 127(23):2833.

[5] 林靈,葉田園,程陽陽,等.從血管神經(jīng)單元角度探討薯蕷皂苷元抗血管性癡呆的作用機(jī)制[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2017,28(06):1432-1435.

[6] Wang L, Ma T, Zheng Y, et al. Diosgenin inhibits IL-1β-induced expression of inflammatory mediators in human osteoarthritis chondrocytes[J]. Int Jes Pathol, 2015, 8(5):4830.

[7] Junchao Y, Zhen W, Yuan W, et al. Anti- trachea inflammatory effects of diosgenin from Dioscorea nipponica through interactions with glucocorticoid receptor[J]. Jintmedres, 2017,45(1):101.

[8] Zheng H, Wei Z, Xin G, et al. Preventive effect of a novel diosgenin derivative on arterial and venous thrombosis in vivo[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2016,26(14):3364-3369.

[9] Hamid F, Kaushal T,Ashraf R, et al. (22β,25R)-3β-Hydroxy-spirost-5-en-7-iminoxy-heptanoic acid exhibitsanti-prostate cancer activity through caspase pathway[J]. Steroids ,2017,119(3)43-52.

[10] Baozhan H, Dan D, Rui Z, et al. Synthesis, characterization and biological studies of diosgenyl analogues[J]. Bloorg Med Chem Lett, 2016, 22(24):1.

[11] 王曉榮,李湧健,程彬彬.薯蕷皂苷元抗腫瘤作用及其機(jī)制研究[J].西部中醫(yī)藥,2014,27(5):140-143.

[12] 劉夢(mèng)萱,張風(fēng)霞.薯蕷皂苷元抗炎作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].湖南中醫(yī)雜志,2016,32(6):205-207.

[13] 劉夢(mèng)萱,張風(fēng)霞,荀麗英,等.薯蕷皂苷元降血脂作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2016,34(4):798-800.

[14] 王彌,李衛(wèi),郭亞春,等.薯蕷皂苷元抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2017,34(6):511-513.

[15] 趙學(xué)榮, 王建平, 肖麗君,等. 17-AAG 阻滯 HCT-15細(xì)胞周期并誘導(dǎo)其凋亡[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2015, 31(1):98-103.

[16] 丁江華, 袁利亞, 陳國(guó)安. 阿司匹林與硼替佐米在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中相互作用的實(shí)驗(yàn)探討[J]. 解放軍醫(yī)藥雜志, 2015(3):50-54.

[17] Tai YT, Acharya C, An G, et al. APRIL and BCMA promote human multiple myeloma growth and immunosuppression in the bone marrow microenvironment[J]. Blood, 2016, 127(25):3225.

[18] 謝家印, 王東, 李夢(mèng)俠,等. APE1/Ref-1 siRNA抑制多發(fā)性骨髓瘤骨髓基質(zhì)細(xì)胞IL-6及IL-8分泌的體外研究[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 31(19):1850-1853.

[19] Alexandrakis MG, Goulidaki N, Pappa CA, et al. Interleukin-10 Induces Both Plasma Cell Proliferation and Angiogenesis in Multiple Myeloma[J]. Pathol Oncol Res, 2015,21(4):929-934.

[20] 田穎,李利紅,楊光忠, 等.小檗堿聯(lián)合硼替佐米對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞作用機(jī)制的體外研究[J].中華血液學(xué)雜志,2016,(11):976-981.

[21] 樊泳希,李永萍.硼替佐米和來那度胺治療多發(fā)性骨髓瘤的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].醫(yī)藥前沿,2016,6(1):182-183.

[22] Chen R, Zhang H, Liu P, et al. Gambogenic acid synergistically potentiates bortezomib-induced apoptosis in multiple myeloma[J]. Cancer, 2017, 8(5):839-851.

[23] 尹靜,郭亞春,張軍霞,等.薯蕷皂苷元對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞增殖及VEGF、IL-6表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥,2017,57(45):31-33.