清肝二十七味丸對酒精性脂肪肝模型大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響△

烏日圖那順

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古 通遼 028007)

酒精性脂肪肝是酒精性肝病的初期階段，也是治療酒精性肝病的關(guān)鍵階段。因?yàn)樵诖穗A段采取科學(xué)的戒酒措施，在1年的時(shí)間內(nèi)將有50%左右的患者能夠逐漸自愈。但還有一半的患者雖然采取戒酒措施，也不能自愈，必須采取治療措施。且在臨床上處于單純的酒精性脂肪肝階段的患者較少。多數(shù)合并酒精性肝炎，甚至肝纖維化或肝硬化。

而現(xiàn)今在臨床缺乏毒副作用小且療效確切的治療藥物。蒙醫(yī)學(xué)在13世紀(jì)就認(rèn)識到了酒的危害。元朝著名的太醫(yī)忽思慧在其撰寫的《飲膳正要》[1]中寫到“酒味苦、甘、辛，性溫，有毒。少量飲用則通筋活絡(luò)，可祛寒，調(diào)節(jié)胃火。如過量飲之，則破三根之平衡，可減壽命。其害處多于益處”。在18世紀(jì)的蒙醫(yī)學(xué)著作《蒙醫(yī)金匱》[2]中專門提到了由酒所致的疾病。并辨證為“赫依偏盛型”“希拉偏盛型”“巴達(dá)干偏盛型”，同時(shí)列出了相應(yīng)的治療方藥。伊希巴拉珠爾的《四部甘露》[3]中也提到了由酒所致的疾病。而現(xiàn)代蒙醫(yī)學(xué)對酒精所致疾病的認(rèn)識較全面。總體上將酒精所致的疾病歸屬于“毒癥”范疇。以疾病的發(fā)展進(jìn)度分為急性中毒期和慢性中毒期。從三根角度分為“赫依偏盛型”“希拉偏盛型”“巴達(dá)干偏盛型”。以侵及的部位分為降于腦、白脈，侵及心、主脈，侵及肝、膽，損傷胃、腸等4型[4-5]。正因?yàn)槊舍t(yī)學(xué)將酒精性脂肪肝歸屬于“毒癥”范疇，所以在本研究中選用了具有調(diào)節(jié)三根之平衡、清熱解毒、增進(jìn)食欲等功效的蒙藥“清肝二十七味丸”做為治療藥物。

而肝細(xì)胞凋亡加快是肝臟實(shí)質(zhì)發(fā)生損傷的最直接的證據(jù)。因此本研究中將其作為觀察指標(biāo)。以此判定蒙藥清肝二十七味丸對酒精性脂肪肝的療效。

1 材料與方法

1.1 動物：雄性Wistar大鼠，90只，體重150～170g，合格號：SCXK-(軍2012-0004)。

1.2 藥物、試劑與儀器：清肝二十七味丸(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供，批準(zhǔn)號：哲衛(wèi)準(zhǔn)字9604-33)，硫普羅寧片(山西云中制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20093445)，原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(由北京嘉美諾斯生物工程有限公司提供)，酶標(biāo)儀(瑞士Roche公司產(chǎn)品，批準(zhǔn)號：11684817910)。

1.3 造模、分組：大鼠隨機(jī)分為2組，空白組15只，以蒸餾水每日0.5mL/100g連續(xù)灌胃8周；造模組75只，以56°白酒逐步增加酒精量灌胃，頭3日稀釋為15%的酒精含量以0.5mL/100g灌胃，再稀釋為30%酒精含量灌胃3日，其后增加到45%的酒精含量灌胃8周[3-4]。8周后空白和造模組每組隨機(jī)選取3只鼠處死后取肝臟，制成肝組織病理切片，顯微鏡下觀察，判定是否造模成功。然后將模型組隨機(jī)分為模型對照組、硫普羅寧組、依赫湯高、中、低劑量組。

1.4 給藥、取材：空白組和模型對照組以1%羧甲基纖維素鈉溶液每日0.5mL/100g連續(xù)灌胃4周；清肝二十七味丸高、中、低劑量組分別用1400mg/Kg、700mg/Kg、350mg/Kg的清肝二十七味丸，以1%羧甲基纖維素鈉溶液配制成混懸溶液后每日0.5mL/100g連續(xù)灌胃4周；硫普羅寧組用40mg/Kg的硫普羅寧片研磨后以1%羧甲基纖維素鈉溶液配制成混懸溶液，每日0.5mL/100g連續(xù)灌胃4周；同時(shí)繼續(xù)造模。4周后各組同時(shí)禁食不禁水16h，用20%烏拉坦0.5mL/100g腹腔注射麻醉，開腹，取肝組織，-20℃冷藏備用。

1.5 指標(biāo)檢測：取肝組織，進(jìn)行石蠟包埋，制備切片，采用原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對組織切片進(jìn)行染色，通過電子顯微鏡觀察，并記錄凋亡的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算凋亡率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以xs表示，各組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組肝細(xì)胞凋亡tunel染色對照(圖1～6)

注：如所示，圖1為空白組肝細(xì)胞凋亡情況，染色淺，表明凋亡非常少；圖2為模型組，染色最深，且面積廣，表明細(xì)胞凋亡明顯升高；圖3為硫普羅寧組，染色明顯變淺，表明凋亡顯著降低；圖4為清肝二十七味丸小劑量組，染色依然深，表明細(xì)胞凋亡無明顯改善；圖5為清肝二十七味丸中劑量組，染色同樣較深，表明細(xì)胞凋亡無明顯改善；圖6為清肝二十七味丸大劑量組，染色明顯變淺，表明細(xì)胞凋亡明顯降低，但不及硫普羅寧組明顯。

2.2 清肝二十七味丸對各組大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響(見表1)

表1 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡率的比較

注：與空白組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01，

3 討論與結(jié)論

酒的主要成份為酒精。而酒精并非機(jī)體所必需物質(zhì)，屬異物，且有毒性。因此長期、大量攝入酒類飲品，就會發(fā)生中毒癥狀。輕者發(fā)生惡心、嘔吐、頭暈等胃腸道和腦神經(jīng)癥狀。重者可導(dǎo)致肝、心、腦、腎等臟器的損傷。而本研究中的酒精性脂肪肝只是酒精性疾病的一類。如不及時(shí)治療，可發(fā)展為酒精性肝硬化，甚至肝癌。

而蒙古族早在13世紀(jì)就深刻認(rèn)識到酒的毒害性。成吉思汗還親自頒布過限酒令[6]。與此同時(shí)蒙醫(yī)學(xué)也在13世紀(jì)就認(rèn)識到了酒的危害，并在古籍文獻(xiàn)中記載了由酒所致的疾病和治療方法。且明確指出酒是有毒的。而現(xiàn)代蒙醫(yī)學(xué)更是將酒精所致的疾病直接歸屬于“毒癥”范疇，并有詳細(xì)的辨證治療方法。因此本研究選用了具有調(diào)節(jié)三根之平衡、清熱解毒、增進(jìn)食欲等功效的蒙藥“清肝二十七味丸”作為治療藥物。

缺糖轉(zhuǎn)鐵蛋白(CDT)是最為特異的酒精性肝病診斷和療效判定指標(biāo),據(jù)研究，每日攝入含酒精60g，血清CDT指標(biāo)就會顯著升高[7]。如果戒酒兩周以上，血清CDT未降低，反而上升，且超過30%者，表明，患者還在酗酒[8]。而肝細(xì)胞凋亡率的上升則是肝實(shí)質(zhì)損傷的更直接的證據(jù)。從本研究結(jié)果看，大劑量清肝二十七味丸組的肝細(xì)胞凋亡率明顯下降，雖不及硫普羅寧，但也發(fā)生顯著下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明蒙藥清肝二十七味丸具有很好的保護(hù)肝臟的作用，并且與劑量成正相關(guān)關(guān)系。因此在本研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，對清肝二十七味丸的組份進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)其有效成份，依據(jù)蒙醫(yī)組方原則，重新進(jìn)行組方，提高臨床療效，廣泛推廣應(yīng)用。

[1]薛雅卓,呼慶偉,李秀紅,等.淺談飲膳正要的基本思想[J].社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志,2007,54:60.

[2]占布拉道爾吉.蒙醫(yī)金匱[M].呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社.1978:967.

[3]伊希巴拉珠爾.四部甘露[M].呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社.1998: 265.

[4]策·蘇榮扎布.蒙醫(yī)內(nèi)科學(xué)[M].蒙醫(yī)藥高等教育內(nèi)部使用教材,1986：187，191.

[5]楊·阿敏.方劑學(xué)[M].遼寧民族出版社,1995：174.

[6]小林高四郎. 成吉思汗(日本語版.阿奇爾譯) [M]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社,1983:213.

[7]A llen JP, L ittenRZ, Anton RF, et a.l C arbohyd rate-d ef icient transferrin as am easure of imm oderate drink ing: rem ain ing is suea[J]. A lcohol C lin Exp Res, 1994, 18 (4) : 799.

[8]魯 彥, 高公民, 李依萍，等.缺糖轉(zhuǎn)鐵蛋白檢測在慢性酒精中毒診斷中的作用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2007,1:91.