鹿茸抗氧化多肽高壓脈沖電場輔助酶法提取及純化工藝優(yōu)化

姜 薇JIANG Wei 金聲瑯 - 殷涌光 -

(1. 黃山學(xué)院旅游學(xué)院，安徽 黃山 245041； 2. 吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長春 130022)

目前，抗氧化劑及其化學(xué)性質(zhì)引起了很多科學(xué)家研究的熱潮。由于體內(nèi)外的氧化壓力使人體產(chǎn)生一系列問題，引發(fā)很多的致命性疾病，如癌癥、動脈硬化、心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)紊亂等[1]。蛋白質(zhì)經(jīng)酶降解后釋放出的生物活性肽能有效清除體內(nèi)過剩的自由基、螯合金屬離子、抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生等避免機體被氧化產(chǎn)生損傷[2]。消費者以及生產(chǎn)廠商更傾向于“天然”食品的抗氧化劑對人體的低損害性，因此從安全無污染的食品中提取天然抗氧化活性多肽已成為研究熱點。

中國是世界上的鹿產(chǎn)業(yè)大國，鹿茸是絕大多數(shù)雄性鹿科動物生長的一種尚未骨化的幼角，也是一種珍貴的具有滋補作用的中藥，主要被加工成鹿茸精作為藥用，且年產(chǎn)量可達20萬瓶之多[3]。但是對于生產(chǎn)鹿茸精過程中的副產(chǎn)物——鹿茸渣卻沒有充分利用。目前，僅有關(guān)于鹿茸渣酸解制備氨基酸、酶法提取硫酸軟骨素、熬制鹿茸渣膠的研究[4]，都存在加工工藝復(fù)雜，提取及利用率低的缺點。

高壓脈沖電場技術(shù)(high intensity pulsed electric fields, PEF)是食品非熱加工技術(shù)之一,被廣泛地應(yīng)用于食品的殺菌處理[5]、酒的催陳[6]、物料的提取[7]等。在較高電場強度下，大部分的酶均會有不同程度損壞而失活[8]，但是少數(shù)的幾種酶在適宜的電場強度下活性會增加[9]，并且能夠顯著提高酶解反應(yīng)產(chǎn)物得率，還未見高壓脈沖電場促進菠蘿蛋白酶解反應(yīng)的相關(guān)報道。

本研究以鹿茸渣蛋白水解度及抗氧化活性為試驗指標(biāo)，選用菠蘿蛋白酶為水解用酶，通過單因素試驗研究底物濃度、酶濃度、電場強度、脈沖數(shù)等對降解鹿茸渣蛋白的影響，并采用響應(yīng)面分析優(yōu)化酶解工藝條件，以提高鹿茸渣制備抗氧化肽的酶解效率及縮短反應(yīng)時間。最后用D201-C大孔樹脂對水解液進行除鹽和粗分，獲得具有高抗氧化活性的鹿茸抗氧化肽組分，從而為利用鹿茸渣生產(chǎn)抗氧化活性多肽提供一定的理論參考和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鹿茸渣：中韓動物研究院；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、水楊酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等：分析純，北京化工廠；

DA201-C大孔樹脂：廊坊淼陽化工有限公司；

菠蘿蛋白酶：300 U/mg，上海寶曼生物有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高速離心機：KEN-002-TY4624型，美國Kendro公司；

紫外可見分光光度儀：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

高壓脈沖電場設(shè)備：實驗室自制(電場操作系統(tǒng)設(shè)計詳見文獻[10])；

噴霧干燥機：SP-1500型，上海順義實驗設(shè)備有限公司；

上海雷磁電導(dǎo)率儀：DDS-307型，上海右一儀器有限公司；

水浴恒溫振蕩器：SHA-C型，金壇市恒豐儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

(1) 水解度(DH)的測定：根據(jù)文獻[11]。

(2) DPPH·清除率的測定：根據(jù)文獻[12]。

(3) ·OH清除率的測定：根據(jù)文獻[13]。

1.2.2 PEF下酶解反應(yīng)的單因素試驗

(1) 固定電場強度5 kV/cm，脈沖數(shù)6，酶添加量6 U/mg，用磷酸緩沖溶液調(diào)鹿茸渣水溶液pH至7.0，分別考察不同底物濃度(5%，10%，15%，20%，25%)對鹿茸蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影響。

(2) 固定電場強度5 kV/cm，脈沖數(shù)6，底物濃度15%，用磷酸緩沖溶液調(diào)pH至7.0，分別考察不同酶添加量(1，3，5，7，9 U/mg)對鹿茸蛋白的水解度和水解液抗氧化活性的影響。

(3) 固定脈沖數(shù)6，底物濃度15%，酶添加量7 U/mg，用磷酸緩沖溶液調(diào)pH至7.0，分別考察不同電場強度(0，5，10，15，20，25 kV/cm)對鹿茸蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影響。

(4) 固定電場強度15 kV/cm，底物濃度15%，酶添加量7 U/mg，用磷酸緩沖溶液調(diào)pH至7.0，分別考察不同的脈沖數(shù)(4，6，8，10，12)對鹿茸蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影響。

1.2.3 PEF下酶解反應(yīng)多因素試驗 根據(jù)中心設(shè)計試驗原理，綜合單因素試驗結(jié)果，固定底物濃度15%，pH 7.0，考察菠蘿蛋白酶濃度、電場強度和脈沖數(shù)對酶解液抗氧化活性的影響，根據(jù)試驗結(jié)果確定最佳制備工藝。

1.2.4 大孔吸附樹脂脫鹽及分離 利用大孔吸附樹脂去除酶解反應(yīng)過程中添加的無機鹽，并對鹿茸抗氧化肽進行純化。將一定體積處理好的濕樹脂慢慢裝入Φ1.5 cm×50 cm 的玻璃柱中，用去離子水洗至洗脫液在220 nm處的吸光值平穩(wěn)，用1 BV/h的流速上樣，上樣體積50 mL。然后用去離子水和不同濃度(25%，50%，75%，100%)乙醇作為洗脫劑，對吸附后樹脂進行洗脫。收集洗脫液，用紫外分光光度計在220 nm處測吸光值，用電導(dǎo)率檢測洗脫液中的離子強度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 底物濃度對酶解反應(yīng)的影響 由圖1可以看出，隨著底物的增加，鹿茸蛋白的水解度先增加后減少，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?5%時，鹿茸蛋白的水解度[(14.23±0.11)%]及清除DPPH·的能力[(72.42±0.09)%]均達到最大值，當(dāng)?shù)孜餄舛冗^高時，由于底物濃度超過了蛋白酶能降解的底物量，所以水解度反而降低。這是因為酶解位點是一定的，酶相對于底物的酶切位點不足，且過高的底物濃度降低了水解產(chǎn)物的分子運動速率，從而降低酶與酶切位點的接觸幾率[15]。這一結(jié)果和姜惠敏等[16]制備羊胎盤抗氧化肽的變化趨勢相似。

2.1.2 酶添加量對酶解反應(yīng)的影響 由圖2可以看出，酶添加量從1 U/mg增加到7 U/mg時，鹿茸蛋白水解度和水解液的DPPH·清除率呈直線上升趨勢，在7 U/mg時達到最大值，隨后水解度和水解液的DPPH·清除率反而下降，與唐夢茹等[17]的研究結(jié)果相似。這是因為在酶相對于底物達到飽和之前，隨著酶添加量的增加，可以使酶與底物的接觸機率增高，底物被水解的程度也隨之增加，但當(dāng)?shù)孜锵鄬γ笣舛冗_到飽和時，酶的進一步添加反而導(dǎo)致酶分子之間起到競爭性抑制作用，增加試驗的操作成本[18]。故酶的最優(yōu)添加量為7 U/mg。

圖1 底物濃度對鹿茸蛋白水解度和DPPH·清除率的影響

Figure 1 The influence of substrate concentration on degree of hydrolysis and scavenging rates of DPPH·

圖2 酶添加量對鹿茸蛋白水解度和DPPH·清除率的影響

Figure 2 The influence of enzyme concentration on degree of hydrolysis and scavenging rates of DPPH·

2.1.3 電場強度對酶解反應(yīng)的影響 由圖3可以看出，電場強度對鹿茸蛋白的水解度和水解液抗氧化活性的影響很明顯。電場強度為15 kV/cm時鹿茸蛋白的水解度和水解液抗氧化活性最高，與菠蘿蛋白酶在此電場條件下的活力最高相一致(圖4)。這是因為在適宜的電場強度下，酶的結(jié)構(gòu)被改變，活性中心暴露出來提高了蛋白酶的活性[19]；同時物料的細胞膜也可被電場擊穿而導(dǎo)致細胞內(nèi)容物滲出，提高酶與底物的接觸機會。

2.1.4 脈沖數(shù)對酶解反應(yīng)的影響 從圖5可以看出，隨脈沖數(shù)從2增加到12，鹿茸蛋白的水解度和水解液抗氧化活性先增加后減少，當(dāng)脈沖數(shù)為8時達到最大值。在相同的流量下，反應(yīng)時間與脈沖數(shù)有關(guān)，因此當(dāng)脈沖數(shù)增加時，反應(yīng)時間增加，酶的活性變得不穩(wěn)定，所以過高的脈沖數(shù)反而不利于酶的溶解反應(yīng)[20]。這一結(jié)果可以從圖6中脈沖數(shù)對菠蘿蛋白酶活力的影響得到驗證。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 試驗設(shè)計及結(jié)果 試驗因素水平設(shè)計見表1，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

圖3 電場強度對鹿茸蛋白水解度和DPPH·清除率的影響

Figure 3 The influence of electric field strength on degree of hydrolysis and scavenging rates of DPPH·

圖4 電場強度對菠蘿蛋白酶活性的影響Figure 4 The influence of electric field strength on enzyme activity

圖5 脈沖數(shù)對鹿茸蛋白水解度和DPPH·清除率的影響

Figure 5 The influence of pulses number on degree of hydrolysis and scavenging rates of DPPH·

圖6 脈沖數(shù)對菠蘿蛋白酶活性的影響Figure 6 The influence of pulses number strength on enzyme activity

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素水平編碼Table 1 Factors and levels of RSM optimization experiments

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化方案及試驗結(jié)果Table 2 Design and experimental results of RSM

2.2.2 模型建立與數(shù)據(jù)分析 用Design Expert 7.0軟件對試驗結(jié)果進行回歸分析，得到鹿茸蛋白水解液對DPPH·清除率與電場強度、酶添加量、脈沖數(shù)之間的二次回歸方程為：

(1)

去除不顯著項后的公式為：

(2)

從方程中可以看出電場強度和脈沖數(shù)對水解液清除DPPH·的能力起到正影響，酶添加量對其抗氧化活性起到負面影響，但是電場強度和脈沖數(shù)均可以對酶添加量產(chǎn)生負面影響。各項的二次方均為負面影響，即因素值的大量提高都不利于抗氧化活性肽的產(chǎn)生，只能小幅度的調(diào)節(jié)三者的比例，才能酶解出高抗氧化活性的多肽溶液。

從表3中可以看出，回歸模型的P<0.000 1，表明試驗設(shè)計得出的二次方程模型達到了極顯著水平，該模型可以用來分析和預(yù)測鹿茸蛋白酶解制備抗氧化多肽的效果。同時模型失擬項(0.172 8)不顯著，說明試驗誤差較小，回歸方程與實際值相似度較高。對水解液清除DPPH·的能力影響最顯著的是電場強度(P<0.000 1)，其次為酶添加量(P<0.05)，最后為脈沖數(shù)。各因素的二次方值對水解液的抗氧化活性的影響均較顯著(P<0.01)，電場強度與脈沖數(shù)的交互作用較顯著(P<0.01)，其次為酶添加量與電場強度(P<0.05)，最后為酶添加量與脈沖數(shù)沒有交互作用。說明在設(shè)定的脈沖數(shù)范圍內(nèi)，酶的活性受電場強度的影響較明顯，從而導(dǎo)致水解液抗氧化活性能力的提高。

表3 響應(yīng)面模型方差分析?Table 3 ANOVA for the response surface quadratic model

? P>F的值小于0.05，影響顯著(*)；P>F的值小于0.01，極其顯著(**)。

從圖7和8可知，電場強度與酶添加量之間具有顯著的交互作用，其次是場強和脈沖數(shù)，這與表3結(jié)果一致。采用分析軟件分析得到鹿茸蛋白酶解制備抗氧化肽的最佳工藝條件：電場強度17.3 kV/cm，脈沖數(shù)7.18、酶添加量7.04 U/mg，根據(jù)高壓脈沖電場實際操作條件，脈沖數(shù)調(diào)整為7。此時鹿茸酶解液的DPPH·清除率可達74.49%。為了檢驗?zāi)Ｐ团c實際值的相似性，將試驗條件調(diào)整為最佳參數(shù)值，進行3次平行試驗，測定酶解液清除DPPH·的活性為(74.76±2.03)%，理論預(yù)測值與實際值非常接近，從而進一步驗證了回歸模型的合適性。

2.3 鹿茸抗氧化肽的大孔吸附樹脂脫鹽及純化

DA201-C大孔樹脂對鹿角茸多肽的除鹽和粗分洗脫曲線見圖9。DA201-C大孔樹脂的疏水性能很強，有機物質(zhì)通過疏水基團可以吸附到大孔樹脂的表面上。鹿茸蛋白經(jīng)菠蘿蛋白酶水解后，隨著蛋白質(zhì)中肽鍵的斷裂，蛋白分子的構(gòu)象發(fā)生了改變，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的疏水氨基酸被暴露出來，從而使蛋白質(zhì)混合物的疏水性增加，而吸附到樹脂上。相反，無機鹽不能吸附到大孔樹脂上，可以被去離子水洗脫下來，從而與多肽分開，而達到除鹽的效果[21-22]。根據(jù)乙醇溶液能改變多肽溶液的非極性側(cè)鏈的排水傾向，從而可以將多肽從樹脂上置換到洗脫液中，而被洗脫下來，疏水性越高的多肽，洗脫的乙醇濃度越高[23]。

2.4 純化多肽抗氧化能力

圖7 電場強度和脈沖數(shù)交互作用等高線圖和響應(yīng)面圖Figure 7 Response surface and contour plots for the interaction effects of electric filed intensity and pulse number

圖8 電場強度和酶添加量交互作用等高線圖和響應(yīng)面圖Figure 8 Response surface and contour plots for the interaction effects of electric filed intensity and bromelain concentration

圖9 鹿茸多肽除鹽和粗分的洗脫曲線Figure 9 The desorption curves of desalination and separation of antler peptides

圖10 粗多肽及各洗脫部分的抗氧化活性Figure 10 Antioxidant activities of crude peptide and each fraction

3 結(jié)論

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