絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1在糖尿病大鼠腎組織細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)中的作用

王麗暉，吳廣禮，林 靜，黃旭東，楊新軍，汪晶華，陳云爽，趙 維

腎小球硬化是糖尿病腎病(DN)的基本病理改變，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重構(gòu)是導(dǎo)致腎小球硬化的主要原因之一[1]。高糖狀態(tài)下蛋白質(zhì)非酶糖化增高，腎臟血流動(dòng)力學(xué)紊亂、細(xì)胞增殖和凋亡及細(xì)胞通路的激活等參與了DN腎小球硬化的發(fā)生和發(fā)展[2]。研究表明，絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，尤其是p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白活化后，可以激活多種核轉(zhuǎn)錄因子，影響目的基因表達(dá)，在一定程度上加速了DN的病變過程[3]。有關(guān)p38 MAPK信號(hào)通路在DN發(fā)病機(jī)制中的研究較多，但其在DN腎小球硬化中的表達(dá)如何調(diào)整，受何種因素調(diào)節(jié)，目前尚未有進(jìn)一步的研究。絲裂原活化蛋白激酶磷酸-1(MKP-1)可通過使MAPK脫磷酸化進(jìn)而使MAPK滅活，是MAPK信號(hào)通路的特異性負(fù)性調(diào)節(jié)因子[4]。在DN的ECM重構(gòu)中MKP-1的作用，和其與p38 MAPK相互作用，目前尚不得知。本研究擬通過糖尿病大鼠腎組織中MKP-1蛋白及mRNA的表達(dá)情況，觀察MKP-1與p38 MAK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的相互作用，以揭示DN時(shí)ECM重構(gòu)可能發(fā)生的機(jī)制，為進(jìn)一步防治DN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠60只，河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：1607934。1～12周齡，體重120～150 g，性周期4～5 d。飼養(yǎng)條件：按性周期一致性原則，每3只合并一籠，室溫21～22℃，濕度67%～75%，光照比例1:1。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 鏈脲佐菌素(STZ，sigma公司，美國(guó))；兔抗大鼠MKP-1和鼠抗大鼠p-p38 MAPK 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；兔抗大鼠纖維粘連蛋白(Laminin，LN)和小鼠抗大鼠纖維粘連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)均購(gòu)自美國(guó)Neomarker 公司；免疫組化試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；考馬斯亮藍(lán)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；聚偏二氟乙烯膜( PVDF)購(gòu)自美國(guó)merckmillipor公司； RT-PCR試劑為美國(guó)Promega 公司；Trizol購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1糖尿病腎病大鼠模型的構(gòu)建：按65 mg/kg腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素(STZ，溶于0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液， PH=4.5)建立糖尿病模型，48 h后大鼠尾尖取血測(cè)定血糖，取尿測(cè)尿糖。血糖≥16.7 mmol/L，尿糖3+～4+者確定為建模成功。建模成功的大鼠隨機(jī)分為1、2、4、8和12周組，每組10只，實(shí)驗(yàn)觀察期間大鼠自由進(jìn)食飲水，不使用降糖藥物和胰島素。另選取10只大鼠為正常對(duì)照組，只注射相同體積的枸櫞酸緩沖液(pH=4.5、0.1 mol/L)。

1.3.2腎組織標(biāo)本收集：糖尿病模型組制模成功后1、2、4、8、12周分別處死動(dòng)物，切取腎臟，去掉被膜，濾紙吸干血跡后稱重，留取部分腎組織迅速置于-70℃液氮中提取RNA和蛋白質(zhì)，留作反轉(zhuǎn)錄聚合鏈連反應(yīng)(RT-PCR)和Western實(shí)驗(yàn)檢測(cè)；部分置于新鮮配制的4%多聚甲醛溶液(0.01 mol/L PBS 配制)進(jìn)行固定，留作常規(guī)腎臟病理和免疫組化檢測(cè)。

1.3.3免疫組化染色檢測(cè)腎皮質(zhì)MKP-1、p-p38 MAPK和LN的表達(dá)：用SP法(鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶聯(lián)結(jié)法)，切片厚4 μm，常規(guī)脫蠟水化，一抗為免抗鼠MKP-1和LN多克隆抗體(1∶50稀釋)，鼠抗p-p38 MAPK單克隆抗體(1∶100稀釋)，二抗為生物素化羊抗兔或鼠IgG(1∶100稀釋)，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，DAB顯色，光鏡觀察陽(yáng)性信號(hào)，陽(yáng)性部位呈棕黃色。免疫組化結(jié)果應(yīng)用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，LN陽(yáng)性結(jié)果胞質(zhì)著色，分別測(cè)量出每個(gè)腎小球LN的著色陽(yáng)性面積、積分光密度(IOD)和腎小球面積，以前兩個(gè)參數(shù)與腎小球面積比表示該成分的相對(duì)含量和表達(dá)強(qiáng)度。p-p38 MAPK、MKP-1等胞核著色的免疫組化結(jié)果檢測(cè)每個(gè)腎小球視野內(nèi)陽(yáng)性胞核細(xì)胞數(shù)與所有腎小球細(xì)胞數(shù)之比，作為陽(yáng)性百分比。每組分析6個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本切片分析20個(gè)完整的腎小球，20個(gè)腎小球均值代表一只大鼠某種成分在腎小球中的相對(duì)含量和表達(dá)強(qiáng)度。20個(gè)腎小球“陽(yáng)性百分比”代表一只大鼠某種成分在腎小球中的表達(dá)，以IOD表示其表達(dá)強(qiáng)度。

1.3.4Western blotting檢測(cè)腎皮質(zhì)細(xì)胞MKP-1和p38 MAPK的活性：取-70℃保存的腎皮質(zhì)約100 mg，加入預(yù)冷的蛋白裂解液0.5 ml。取100 μg蛋白加入上樣緩沖液，應(yīng)用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜,分別與兔抗大鼠MKP-1和p-p38MAPK多克隆抗體(1∶100)，4℃ 過夜后，再度洗膜后加入1∶2500稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，37℃，2 h。洗膜后加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL, Santa Cruz公司) 試劑,將PVDF膜放入X光片暗盒,壓片,顯影,定影。用美國(guó)Kodak公司1D數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件對(duì)Western條帶進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3.5RT-PCR檢測(cè)腎皮質(zhì)MKP-1和FN mRNA的表達(dá)：采用Trizol提取腎皮質(zhì)RNA，應(yīng)用紫外可見分光光儀測(cè)定RNA的純度和含量。取總RNA 2 μg作為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶(US)催化下合成cDNA，以適量cDNA 為模板在Taq DNA聚合酶催化下在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。MKP-1，F(xiàn)N及GAPDH引物均由北京奧科生物工程有限公司合成，使用的基因引物如下：MKP-1 F：5'- ACA GGG CAG AAG GGA AAG GAC -3'， R：5' - GCT GAA AGC CTG CTC TGG GTC -3' 產(chǎn)物：263bp；FN：F:5′CTGAACCAGCCTACGGATGACT3′R：5′CCGTCGTCATAACACGTTGCT3′產(chǎn)物305b；GAPDH： F：5′TATCGGACGCCTGGTTAC3′R：5′CTGTGCCGTTGAACTTGC3′ 產(chǎn)物140bp。PCR反應(yīng)條件：94℃，5 min；95℃，1 min；采用退火溫度分別為55.9℃、54.9℃和56.9℃，1 min；72℃，1 min；擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)，最后72℃，10 min。取5ul PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，觀察條帶情況。應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)(UVP GD S800,U S) Labworks 4.5軟件測(cè)定IOD,并以GAPDH基因表達(dá)量為內(nèi)參照，以目的產(chǎn)物與GAPDH的積分光密度比值表示mRNA相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1免疫組化檢測(cè)結(jié)果 MKP-1主要在腎小球的內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞的胞核中表達(dá)，在對(duì)照組腎小球和腎小管的細(xì)胞核著色較強(qiáng)，在糖尿病組表達(dá)明顯減少(見圖1)。p38 MAPK主要表達(dá)在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜區(qū)及臟層上皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，偶有近端和遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)，與對(duì)照組比較糖尿病組的表達(dá)較強(qiáng)(見圖2)。LN的陽(yáng)性染色主要分布于毛細(xì)血管基膜、腎小球囊壁和腎小管基膜和系膜區(qū)，在腎間質(zhì)中也有表達(dá)，與對(duì)照組比較，糖尿病組表達(dá)增強(qiáng)(見圖3)。圖像分析結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，糖尿病組MKP-1表達(dá)在1～8周表達(dá)量明顯減少(P<0.01)；第12周表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。糖尿病組p38 MAPK在 1～8周時(shí)表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)，在 12周時(shí)與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。LN在糖尿病組的表達(dá)從4～12周均明顯增高(P<0.01)。見表1。

圖1免疫組化檢測(cè)MKP-1在兩組大鼠腎組織中的表達(dá)(DAB×400)

圖2免疫組化檢測(cè)p-p38MAPK在兩組大鼠腎組織中的表達(dá)(DAB×200)

圖3免疫組化檢測(cè)Lamain在兩組大鼠腎組織中的表達(dá)(DAB×400)

表1 兩組大鼠腎組織中p-p38 MAPK 、MKP-1和LN的表達(dá)

注：p-p38 MAPK為磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶，MKP-1為絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1，LN為層粘連蛋白；與對(duì)照組相比，bP<0.01

2.2Western blotting檢測(cè)結(jié)果 糖尿病組1～8周MKP-1蛋白的表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.01)，但在糖尿病12周時(shí)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。p38蛋白激酶的活性從糖尿病1周時(shí)開始升高，在4、8周時(shí)達(dá)到高峰(P<0.01)；在12周時(shí)與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.05)。見圖 4，表2。

圖4兩組大鼠腎皮質(zhì)P-p38MAPK和MKP-1的動(dòng)態(tài)變化

1代表對(duì)照組 ，2、3、4、5、6代表糖尿病組 1、2、4、8、12周

表2 兩組大鼠腎皮質(zhì)中MKP-1和p-p38 MAPK的表達(dá)

注：MKP-1為絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶，p-p38 MAPK為磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶；與對(duì)照組相比，bP<0.01

2.3RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 MKP-1 mRNA的表達(dá)在糖尿病1-8周時(shí)低于對(duì)照組(P<0.01)，12周時(shí)與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較，F(xiàn)N mRNA在糖尿病第2周開始升高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)越來(lái)越強(qiáng)(P<0.01)。而各磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)幾乎保持恒定(表3，圖5)。

表3 兩組大鼠腎皮質(zhì)中MKP-1和FN mRNA的表達(dá)

注：MKP-1為絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶，F(xiàn)N為纖維粘連蛋白；與對(duì)照組相比，bP<0.01

圖5兩組大鼠腎皮質(zhì)中MKP-1和FNmRNA的動(dòng)態(tài)變化

3 討論

糖尿病腎病時(shí)ECM重構(gòu)是糖尿病腎小球硬化的基礎(chǔ)；既往研究表明，高糖有可能是導(dǎo)致ECM重構(gòu)的直接因素；血流動(dòng)力學(xué)異常、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子等均可導(dǎo)致ECM重構(gòu)的發(fā)生[5]。MAPK家族在各種刺激因子的作用下，通過使核轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡的調(diào)節(jié)；p38 MAPK被激活后進(jìn)入細(xì)胞核，使核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活化，從而調(diào)節(jié)相應(yīng)目的基因轉(zhuǎn)錄，在一定程度上導(dǎo)致和加速了DN的發(fā)生、發(fā)展[6]。認(rèn)為p38 MAPK是細(xì)胞信息傳遞的交匯點(diǎn)或共同通路[7]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病組p38 MAPK的磷酸化水平在DM 1周時(shí)開始升高，在4～8周時(shí)達(dá)到高峰，在DM 12周時(shí)其活性與對(duì)照組無(wú)明顯差異。而作為ECM主要成分的LN在糖尿病組從4～12周表達(dá)明顯增高，并隨病程的延長(zhǎng)而表達(dá)增強(qiáng)。提示p38蛋白激酶活化后，可以使LN的表達(dá)明顯增強(qiáng)，p38MAPK通路在糖尿病大鼠的ECM的重構(gòu)中發(fā)揮一定作用。我們既往研究發(fā)現(xiàn)[8]，體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞在高糖狀態(tài)下p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白磷酸化水平提高，可以上調(diào)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)mRNA的表達(dá)，從而刺激細(xì)胞上清液中FN和LM的分泌。Rane等[9]觀察了體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞，在高糖狀態(tài)下凋亡基因增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞增多，提示p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不僅在腎小球系膜細(xì)胞中發(fā)揮作用，同時(shí)參與腎小管上皮細(xì)胞的凋亡過程。目前針對(duì)DN的治療主要是控制血壓、控制血糖、改善腎臟微循環(huán)等，但也難以逆轉(zhuǎn)DN的進(jìn)程。所以選擇抑制p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，有可能在糖尿病腎病的預(yù)防和治療中發(fā)揮一定作用。

MKP-1是MAPKs的天然負(fù)性調(diào)節(jié)因子，對(duì)MAPKs 的去磷酸化作用有重要的意義[10]。MAPKs 調(diào)節(jié)位點(diǎn)中保守的蘇氨酸或酪氨酸基團(tuán)可被雙特異性蛋白激酶磷酸化激活，而雙特異性蛋白磷酸酶可使同樣位點(diǎn)的蘇氨酸或酪氨酸基團(tuán)去磷酸化，從而使活化的MAPKs主要被蛋白磷酸酶去磷酸化而失活[11]。Kato等[12]觀察心房利鈉肽(ANP)對(duì)體外培養(yǎng)的腎小球足細(xì)胞的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，ANP可增加MKP-1的活性，同時(shí)阻斷p38 MAPK的活性，導(dǎo)致凋亡基因Bax和 Bax/Bcl2的表達(dá)下降。p38 MAPK的阻斷劑FR167653，可以降低血壓，降低尿蛋白排出，減輕節(jié)段硬化，足細(xì)胞受損和細(xì)胞凋亡。因此，ANP通過阻斷p38 MAPK通路，增加MKP-1的活性起到腎臟保護(hù)功能。蛋白磷酸酶的活性是蛋白激酶活性的100～1000 倍，故將注意力放在蛋白磷酸酶的生理作用上。一般認(rèn)為MKP-1 的特異性選擇底物是p38，在一些情況下也可能是JNK 或ERK[13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病模型大鼠在注射鏈脲佐菌素1周后，MKP-1活性及mRNA 表達(dá)較對(duì)照組下降，并持續(xù)到第8周，在第12周時(shí)其蛋白及mRNA的表達(dá)下降。而p38 MAPK的活性在1周時(shí)開始升高，F(xiàn)N、LN水平在第4周升高，p38 MAPK的活性及FN、LN的表達(dá)升高持續(xù)到12周。MKP-1的活性下降早于FN和LN。提示糖尿病狀態(tài)下，大鼠腎組織MKP-1的蛋白和mRNA的表達(dá)均下降，而且MKP-1活性的下降晚于p38 MAPK活性的上升，提示高糖可以使MKP-1的合成減少，降解增加。文獻(xiàn)報(bào)道，高糖培養(yǎng)大鼠的腎小球系膜細(xì)胞MKP- 1 蛋白的表達(dá)明顯下降，而p38 MAPK 活性增加[14]。提示糖尿病腎病時(shí)p38 MAPK 活化是由于磷酸化增強(qiáng)、MKP- 1 的脫磷酸化減弱所致。

一般認(rèn)為， MKP-1是一種細(xì)胞核酶，能快速調(diào)整MAPK的去磷酸化，短時(shí)間內(nèi)發(fā)揮作用。Fang等[4]觀察提示越早期應(yīng)用胰島素可使MKP-1表達(dá)增加，降低p38 MAPK活性，有效減輕腎臟肥大的發(fā)生。Gorostizaga等[15]曾發(fā)現(xiàn)當(dāng)近端腎小管上皮細(xì)胞暴露于高濃度白蛋白培養(yǎng)液下， MKP-1水平在15 min即快速升高，在6 h時(shí)達(dá)到頂峰，隨即下降。尿白蛋白通過基因轉(zhuǎn)錄的激活可使MKP-1 mRNA水平短暫升高(1 h為對(duì)照組的3倍)。尿中白蛋白不僅觸發(fā)MAPK的活化也緊緊地上調(diào)MKP-1表達(dá)。所以推測(cè)MKP-1 的短半衰期與MAPK對(duì)其磷酸化作用[16]。Winiarska等[17]研究結(jié)果提示細(xì)胞活動(dòng)中MKPs 的表達(dá)是繼發(fā)于MAPK 激活后，即MKPs 的表達(dá)是細(xì)胞對(duì)MAPK 通路激活的一種反饋。MKP-1在低滲應(yīng)激下可激活p38 MAPK， 誘導(dǎo)β和γ-腎小管上皮細(xì)胞鈉通道蛋白的表達(dá)。PD98059作為MEK抑制劑，可以誘導(dǎo)MKP-1的表達(dá)從而抑制p38MAPK的活化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，模型大鼠在第2周時(shí)p38 MAPK的活性表達(dá)增強(qiáng)，MKP-1的蛋白表達(dá)下降，提示MKP-1對(duì)p38 MAPK的負(fù)調(diào)節(jié)是繼發(fā)于p38 MAPK激活后，同時(shí)這種磷酸化作用可以抑制蛋白酶對(duì)MKP-1 的降解，從而增強(qiáng)其穩(wěn)定性，MKP-1 表達(dá)也受到MAPKs 的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。MKP-1 與MAPKs 之間相互作用，相互影響。

綜上所述， MKP-1 是p38 MAPK 的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可以對(duì)p38 MAPK 的主要通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，并抑制其下游反應(yīng)。激活后可使糖尿病大鼠腎組織的細(xì)胞外基質(zhì)的含量降低，在DN的ECM重構(gòu)中發(fā)揮保護(hù)作用，可減輕DN病理改變，延緩DN發(fā)生和發(fā)展。如果能發(fā)現(xiàn)能使提高M(jìn)KP-1 的表達(dá)的藥物，可對(duì)抗高糖對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)的影響，從而為臨床治療DN提供理論基礎(chǔ)。

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