食品級二氧化鈦的口服安全性評估

□ 張?zhí)煊?謝志雄 武漢大學生命科學學院

1 前言

二氧化鈦具有高亮度、高折射率、良好的抗污性、耐光性等特性，被廣泛用作食品添加劑和色素[1]，二氧化鈦是符合我國GB2760-2014《食品添加劑使用標準》規(guī)定的食品添加劑，其最大添加劑量可達1%[2]。

最近在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，食品級二氧化鈦會在小腸上皮細胞表面聚沉，并且會導致小腸絨毛結構損傷，引起炎癥反應，導致小腸吸收效率降低[3-4]；體內實驗中，一次性口服100 mg食品級二氧化鈦后，利用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）分析發(fā)現(xiàn)，2 h后二氧化鈦會進入血液循環(huán)系統(tǒng)并在6 h達到峰值[5]，進入血液循環(huán)系統(tǒng)中的二氧化鈦顆粒會聚集在許多器官中，由于肝臟和腎臟是重要的解毒和代謝器官，二氧化鈦顆粒在兩個部位的聚集尤其突出，推測這些二氧化鈦可能會造成肝、腎功能損傷[6]。但是，這些研究的實驗體系并不符合日常生活中食品級二氧化鈦的攝入方式。

為了更好探究日常生活中口服攝入的食品級二氧化鈦（最高添加劑量1%）是否會對肝腎功能、小腸結構和吸收效率等產生影響，采用大鼠模型連續(xù)四周以每兩天灌胃喂食食品級二氧化鈦顆粒溶液1 000 mg/kg體重/次的頻率進行了探究。

2 材料和方法

2.1 實驗材料

2.1.1 二氧化鈦

食品級二氧化鈦（GB25577-2010），購自上海江滬鈦白化工制品有限公司。

2.1.2 大鼠

SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠購于自湖北省疾病預防控制中心。大鼠均為雄性，6周齡，體重230±6 g。

2.1.3 試劑和溶液

組織固定液：購于武漢賽維爾生物技術有限公司。

木糖檢測試劑盒：購于南京信帆生物技術有限公司。

2.2 實驗方法與步驟

2.2.1 大鼠的飼養(yǎng)和灌胃處理

大鼠自湖北省疾病控制中心買回后，飼養(yǎng)在武漢大學生命科學學院SPF級動物房中，實驗開始前十天為大鼠適應動物房生活時期。動物房光照條件為12 h黑暗、12 h光照，食物和水均可自由獲得。大鼠均為1只/籠，以排除大鼠間的相互影響。

實驗開始后，將大鼠按6只/組隨機分為實驗組和對照組，實驗組大鼠以每兩天一次的頻率灌胃喂食1 000 mg/kg體重的二氧化鈦，對照組以相同頻率灌胃喂食相同體積的無菌水，連續(xù)灌胃處理四周。

2.2.2 肝腎功能指標的獲取

灌胃四周后，對大鼠進行麻醉處理，通過頸動脈取血1 mL后3 000 rpm離心10 min，取血清利用血液生化分析儀進行生化指標的測量。

2.2.3 小腸吸收效率的測評

以D-木糖吸收效率評估小腸吸收效率，方法如下：灌胃四周后，禁食大鼠12 h，灌胃喂食0.8 g/kg體重D-木糖；2 h后麻醉大鼠，通過頸動脈取血1 mL后3 000 rpm離心10 min，取血清；然后利用D-木糖檢測試劑盒測量血清中D-木糖的含量；最后，用血清中的D-木糖含量評估實驗組與對照組大鼠小腸的吸收效率。

2.2.4 小腸生理切片的制備

灌胃四周后，將大鼠進行麻醉處理，取小腸后浸于組織固定液24 h。固定完成后，委托武漢賽維爾生物技術有限公司進行石蠟包埋和切片的制備。

2.2.5 食物、水消耗量和體重增長的統(tǒng)計

在灌胃期間，每兩天測量一次食物消耗量、飲水量和體重數(shù)據(jù)。

2.2.6 結果的統(tǒng)計與分析

對照組和實驗組中大鼠數(shù)量均≥3，實驗結果數(shù)值代表平均值±標準誤差。顯著性分析利用SigmaPlot 12.5的T檢驗進行。

3 結果與分析

3.1 口服二氧化鈦對肝、腎功能的影響

血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）和球蛋白（GLOB）的含量一般作為肝功能檢測的主要指標，肝臟被損傷時，血清中的ALT和AST含量會升高，而ALB含量會降低[7]；血清中尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、尿酸（UA）的含量以及尿素氮與肌酐的比值（BUN/CREA）一般作為腎功能檢測的主要指標，腎臟被損傷時，血清中的BUN、CREA和UA含量會增加[8]。

圖1 灌胃四周后對照組與實驗組大鼠的肝臟、腎臟功能指標

通過對大鼠血清中相關生化指標的分析，發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠肝臟和腎臟功能指標均與對照組大鼠沒有產生顯著性差異（如圖1所示）。結果表明，持續(xù)四周每兩天灌胃一次1 000 mg/kg體重食品級二氧化鈦不會對大鼠肝、腎臟功能造成顯著影響。

3.2 口服二氧化鈦對小腸結構和功能的影響

利用小腸生理切片和D-木糖的吸收實驗評估了二氧化鈦對小腸生理結構與功能產生的影響[9]。通過對小腸切片的觀察和分析發(fā)現(xiàn)灌胃喂食四周后，大鼠小腸上皮和絨毛結構完整，沒有出現(xiàn)炎癥反應，上皮細胞也沒有出現(xiàn)明顯的壞死、脫落現(xiàn)象（如圖2所示）。

D-木糖的吸收實驗表明，連續(xù)四周的灌胃喂食食品級二氧化鈦并沒有對小腸的吸收功能造成顯著性的影響（如圖3所示）。

3.3 口服二氧化鈦對體重增長的影響

通過對四周內大鼠食物消耗量和飲水量的統(tǒng)計與分析發(fā)現(xiàn)，實驗組大鼠與對照組大鼠在飲水和食量上并沒有顯著差異，表明食品級二氧化鈦并沒有導致大鼠厭食或者暴飲暴食，大鼠的體重增長速度也表明，灌胃喂食二氧化鈦并沒有對大鼠的體重增長產生影響（如圖4所示）。

圖2 灌胃四周后對照組與實驗組大鼠的小腸生理切片

圖3 D-木糖吸收實驗

4 討論

圖4 對照組和實驗組大鼠在灌胃處理四周內的飲水量和食用食物量（左）和體重增長（右）

隨著公眾對健康飲食關注度的提升，食品級二氧化鈦作為食品添加劑和色素的潛在影響引起了廣泛的關注。以往對二氧化鈦食品添加劑安全性評估的研究多是通過靜脈、腹膜注射或者體外實驗體系進行。但是，在日常生活中，我們攝入體內的食品級二氧化鈦絕大部分是通過口服途徑，所以，以往研究的實驗體系并不能很好評估二氧化鈦食品添加劑的生物安全性。本實驗利用灌胃喂食大鼠食品級二氧化鈦進行評估的體系和模型，使實驗條件更貼近生活中的自然狀態(tài)，相較于之前研究中的實驗體系，評估方式更合理，實驗數(shù)據(jù)更能反映實際情況，更適合評估食品級二氧化鈦生物安全性。

在以往體外實驗中，小腸絨毛結構直接浸泡于含有二氧化鈦的培養(yǎng)基中，二氧化鈦會由于重力作用聚集在小腸絨毛表面，損傷小腸絨毛結構和功能[4]，而在日常生活中，由于腸胃的蠕動、腸道上皮細胞死亡、再生和腸道粘膜的屏障作用，口服進入腸道的二氧化鈦對小腸絨毛生理結構和功能的影響會減弱，所以，我們的實驗體系更貼近生活中的實際情況；在體內實驗中，通過靜脈等途徑注射的二氧化鈦會直接進入血液循環(huán)系統(tǒng)，聚集在諸多器官中[10]，影響器官功能[6]，而實際生活中進入血液循環(huán)系統(tǒng)和器官中的二氧化鈦總量較少，本實驗建立的模型更貼近日常狀態(tài)下的積累量。

本實驗通過建立比之前相關研究中更合理的評估體系，發(fā)現(xiàn)持續(xù)四周口服攝入含有1%食品級二氧化鈦食物添加劑的食物不會造成大鼠小腸絨毛結構和肝、腎功能損傷，表明國家規(guī)定的食物中最高1%的食品級二氧化鈦食物添加劑量屬于安全劑量。本文對合理評估食品級二氧化鈦應用的安全性具有重要的參考價值，為食品級二氧化鈦食物添加劑安全使用劑量提供了依據(jù)。

[1]Weir A, Westerhoff P,Fabricius L, et al. Titanium dioxide nanoparticles in food and personal care products.[J]. Environmental Science &Technology, 2012, 46(4):2242-2250.

[2]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB2760-2014 食品添加劑使用標準[S].北京:中國標準出版社,2014.

[3]Nogueira C M, Azevedo W M D, Dagli M L Z, et al. Titanium dioxide induced inflammation in the small intestine[J]. World Journal of Gastroenterology, 2012, 18(34):4729.

[4]Faust J J, Doudrick K, Yang Y, et al. Food grade titanium dioxide disrupts intestinal brush border microvilli in vitro independent of sedimentation[J].Cell Biology & Toxicology, 2014,30(3):169-188.

[5]Pele L C, Thoree V, Bruggraber S F, et al. Pharmaceutical/food grade titanium dioxide particles are absorbed into the bloodstream of human volunteers.[J]. Particle & Fibre Toxicology, 2015, 12(1):26.

[6]Jovanovi? B. Critical review of public health regulations of titanium dioxide, a human food additive.[J].Integrated Environmental Assessment& Management, 2015, 11(1):10-20.

[7]郭春何.肝功能指標在脂肪肝患者中的臨床價值[J].臨床醫(yī)學,2017.

[8]王敏,顧潔,曹華.腎功能指標對慢性腎病的預測價值研究[J].臨床檢驗研究論著,2014,35(22):3034-3035.

[9]劉 放 南 ,羅 楠 ,譚 力 ,等 .高效液相色譜法測定成人腸吸收試驗中D-木糖的正常值[J].腸外與腸內營養(yǎng),2004,11(3):184-186.

[10]Geraets L, Oomen A G,Krystek P, et al. Tissue distribution and elimination after oral and intravenous administration of different titanium dioxide nanoparticles in rats[J]. Particle& Fibre Toxicology, 2014, 11(1):30.