頂空氣相色譜法同時(shí)測(cè)定新藥CBT108中12種殘留溶劑

胡美晨 黃金文 黃磊磊 謝達(dá) 朱陽(yáng)斌 王琳 王天興 吳范宏

摘 要 采用頂空氣相色譜技術(shù)，建立了同時(shí)測(cè)定新藥CBT108中12種殘留溶劑的方法。優(yōu)化了平衡加熱時(shí)間和程序升溫時(shí)間以及制樣的溶劑，并通過(guò)驗(yàn)證確定了本方法的合理性、準(zhǔn)確性和可行性。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，采用DB-624型毛細(xì)管柱（6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定液，30 m×0.53 mm×3.0 μm）分離、氫火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)、內(nèi)標(biāo)法定量的分析方案，實(shí)現(xiàn)了甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、庚烷、甲苯和四氯化碳共12種殘留溶劑的同時(shí)分離與測(cè)定。12種溶劑在各自的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)（R2）均>0.997； 以10倍信噪比確定方法定量限，以3倍信噪比確定方法檢出限，分別為：甲醇0.024 μg/mL、0.0072 μg/mL； 乙醇0.1 μg/mL、0.012 μg/mL； 乙醚0.01 μg/mL、0.005 μg/mL； 丙酮0.1 μg/mL、0.008 μg/mL； 乙腈1.025 μg/mL、0.0615 μg/mL； 二氯甲烷0.09 μg/mL、0.06 μg/mL； 正己烷0.0174 μg/mL、0.0145 μg/mL； 乙酸乙酯0.25 μg/mL、0.008 μg/mL； 四氫呋喃0.108 μg/mL、 0.014 μg/mL； 四氯化碳0.16 μg/mL、0.0004 μg/mL； 庚烷0.0075 μg/mL、0.005 μg/mL； 甲苯0.0445 μg/mL、0.0014 μg/mL。在3個(gè)添加水平下，12種殘留溶劑的加標(biāo)回收率在90.96%～108.67%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%～5.7%。結(jié)果表明，本法簡(jiǎn)單、快速、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確性高，可用于實(shí)際藥品中以上12種殘留溶劑的檢測(cè)， 并可對(duì)其它藥物中殘留溶劑的檢測(cè)提供參考。

關(guān)鍵詞 頂空氣相色譜法；殘留溶劑；新藥CBT108；同時(shí)測(cè)定

1 引 言

在藥物合成反應(yīng)中不可避免地會(huì)使用有機(jī)溶劑[1，2]，但是溶劑副產(chǎn)物殘留高于安全值時(shí)，會(huì)產(chǎn)生毒性和致癌作用[3，4]。國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)會(huì)（International Conference for Harmonization， ICH）要求所有藥品均需經(jīng)過(guò)殘留溶劑的檢測(cè)與控制[1]。各國(guó)藥典對(duì)藥品中殘留溶劑法規(guī)的制定均參考ICH頒布的指導(dǎo)原則，依據(jù)PDE將殘留溶劑劃分為四類(lèi)總計(jì)69種[5～7]，并規(guī)定第一、二、三類(lèi)殘留溶劑不得高于藥典規(guī)定的限量，第四類(lèi)應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)工藝特點(diǎn)制定相應(yīng)限量以滿(mǎn)足GMP要求[8]。基于新的毒理學(xué)研究結(jié)果，ICH 在2002年修訂了四氫呋喃和N-甲基吡咯烷酮的PDE，并將四氫呋喃由三類(lèi)溶劑改為二類(lèi)溶劑。2011年BP將環(huán)氧乙烷和二氧六烷不再作為殘留溶劑項(xiàng)， 而另外作為一個(gè)測(cè)定項(xiàng)單獨(dú)列出[9]，即至今各國(guó)藥典對(duì)殘留溶劑的限度要求一致[10～12]。在檢測(cè)方法上，各國(guó)藥典均推薦采用氣相色譜法。BP采用AB雙系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定，系統(tǒng)A主要用于定性分析，系統(tǒng)B用于定量分析； 計(jì)算方法上，ChP采用內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法兩種方式，USP和BP均只采用外標(biāo)法[8，11，12]。本研究所涉及殘留溶劑均屬前三類(lèi)。

目前，殘留溶劑的檢測(cè)方法有差示掃描量熱法[13]、紅外光譜法[14]、核磁共振[15]、氣相色譜法[16，17]等，這些方法除氣相色譜外，專(zhuān)屬性、靈敏度均不能達(dá)到ICH及各國(guó)藥典的要求。氣相色譜由于其高靈敏度、高分離能力，被各國(guó)推薦用于檢測(cè)藥物中殘留溶劑[18～21]。與直接進(jìn)樣和動(dòng)態(tài)頂空氣相色譜法相比，靜態(tài)頂空氣相色譜法更具優(yōu)勢(shì)[3，18，19]。通過(guò)將樣品中殘留溶劑富集在頂空瓶上層氣體中達(dá)到氣-液或氣-固兩相平衡，直接定量取上層氣體進(jìn)樣的方法，可使進(jìn)樣室在較低溫度下操作，避免組分分解，減少難揮發(fā)物質(zhì)對(duì)色譜系統(tǒng)與監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的干擾和污染，從而使分析過(guò)程更加簡(jiǎn)便、快速、靈敏，提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度與可重現(xiàn)性，目前已成為殘留溶劑檢測(cè)的首選方法[2，22，23]。新藥CBT108為上海華理生物醫(yī)藥有限公司與浙江野風(fēng)藥業(yè)有限公司聯(lián)合開(kāi)發(fā)的腫瘤血管靶向性抗腫瘤藥物，目前已啟動(dòng)臨床I期研究，其合成涉及到的殘留溶劑有12種，分別為甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、庚烷、甲苯、四氯化碳。本研究采用靜態(tài)頂空氣相色譜法， 內(nèi)標(biāo)法定量，考察了不同固定相、平衡加熱時(shí)間、升溫程序和制樣溶劑的影響，建立了同時(shí)測(cè)定新藥CBT108中12種殘留溶劑的新方法。本方法快速、準(zhǔn)確，也可作為其它藥物檢測(cè)殘留溶劑的方法依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器及試劑

Agilent Technology GC7890A system氣相色譜儀，配有氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）以及Agilent Technologies G1888型頂空自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）； QPH-300II型氫氣發(fā)生器（上海全浦科學(xué)儀器有限公司）； SGK-2LB低噪音空氣泵（北京東方精華苑科技有限公司）；Metller Toledo XS105分析天平（瑞士Metller公司）； 20 mL頂空進(jìn)樣瓶。

甲醇（純度99.9%）、乙醇（純度99.8%）、乙醚（純度99.7%）、丙酮（純度99.5%）、乙腈（純度99.9%）、二氯甲烷（純度99.5%）、正己烷（純度98%）、正丙醇（純度99.5%）、乙酸乙酯（純度99.5%）、四氫呋喃（純度99.9%）、庚烷（純度99%）、甲苯（純度99.9%）均購(gòu)于美國(guó)Dedia公司； 四氯化碳（純度99.5%，天津市四有精細(xì)化學(xué)品有限公司）。實(shí)驗(yàn)樣品為上海華理生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)的CBT108。

2.2 色譜條件

6 %氰丙基苯基-94 %二甲基聚硅氧烷毛細(xì)管柱（DB624， 30 m×0.53 mm×3.0 μm； Serial No.： US8989746H）。程序升溫：初始溫度40℃保持5 min，以10℃的速率升溫至260℃，保存3 min；載氣為氮?dú)猓籉ID檢測(cè)器， 溫度： 300℃；進(jìn)樣口溫度： 220℃； 分流比：25∶1； 柱流速：3.0 mL/min； 頂空平衡溫度85℃，平衡時(shí)間40 min；定量環(huán)溫度100℃；傳輸管溫度110℃；進(jìn)樣量：1 mL。

2.3 溶液的配制

2.3.1 溶劑及內(nèi)標(biāo)溶液 溶劑為50 % （V/V） N，N-二甲基甲酰胺（DMF）-水， 內(nèi)標(biāo)溶液：取正丙醇適量，加溶劑稀釋制成50 μg/mL的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3.2 對(duì)照品溶液 分別精確稱(chēng)取四氯化碳4 mg，用內(nèi)標(biāo)溶液溶解并稀釋定容至100.0 mL； 使四氯化碳濃度為40 μg/mL； 準(zhǔn)確移取甲醇30 mg、乙醇50 mg、乙醚50 mg、丙酮50 mg、乙腈4.1 mg、二氯甲烷6 mg、正己烷2.9 mg、乙酸乙酯50 mg、四氫呋喃7.2 mg、庚烷50 mg、甲苯8.9 mg和上述濃度為40 μg/mL四氯化碳溶液1.00 mL，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋并定容至100.0 mL； 各有機(jī)溶劑的終濃度分別為：甲醇300 μg/mL， 乙醇500 μg/mL， 乙醚500 μg/mL， 丙酮500 μg/mL， 乙腈 41 μg/mL，二氯甲烷60 μg/mL， 正己烷29 μg/mL，乙酸乙酯500 μg/mL，四氫呋喃72 μg/mL，四氯化碳0.4 μg/mL，庚烷的濃度500 μg/mL， 甲苯89 μg/mL，作為對(duì)照品溶液。

3 結(jié)果與討論

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性與方法專(zhuān)屬性

取內(nèi)標(biāo)溶液10 mL置于20 mL頂空瓶中，密封瓶口，作為空白試驗(yàn)溶液定量進(jìn)樣1 mL； 另取甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、四氯化碳、庚烷、甲苯各l μL置于20 mL頂空瓶中，分別進(jìn)樣，通過(guò)測(cè)定單一溶劑的保留時(shí)間確定混合溶劑樣品各個(gè)峰的歸屬。另取對(duì)照品溶液10.00 mL至頂空瓶中，按擬定色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算出甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、四氯化碳、庚烷、甲苯的理論塔板數(shù)均>5000、分離度均>1.5，各峰面積校正值的RSD在0.3%～3.0%之間，符合藥典規(guī)定各組分理論塔板數(shù)應(yīng)>5000，分離度不小于1.5，峰面積校正值≤10%的標(biāo)準(zhǔn)[8]，對(duì)照品分離色譜圖見(jiàn)圖1， 系統(tǒng)適應(yīng)性及專(zhuān)屬性良好。

3.2 線(xiàn)性關(guān)系、定量限及檢出限

分別取混合對(duì)照品溶液1 mL，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋定容至100 mL，然后分別稀釋成濃度為甲醇0.024～600 μg/mL、乙醇0.1～1000 μg/mL、乙醚0.01～1000 μg/mL、丙酮0.1～1000 μg/mL、乙腈1.025～82 μg/mL、二氯甲烷0.09～120 μg/mL、正己烷0.0174～58 μg/mL、乙酸乙酯0.25～1000 μg/mL、四氫呋喃0.108～144 μg/mL、四氯化碳0.16～0.8 μg/mL、庚烷0.0075～600 μg/mL、甲苯0.0445～178 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積校正值（Y）對(duì)相應(yīng)溶劑的質(zhì)量濃度（X， μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。12種殘留溶劑在各自的濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。以S/N=3計(jì)算檢出限（LOD），以S/N=10計(jì)算定量限（LOQ），結(jié)果列于表1。

3.3 回收率

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版第四部0861殘留溶劑測(cè)定法中的規(guī)定，12種溶劑的殘留限度值分別為：甲醇0.3%、乙醇0.5%、乙醚0.5%、丙酮0.5%、乙腈0.041%、二氯甲烷0.06%、正己烷0.029%、乙酸乙酯0.5%、四氫呋喃0.072%、四氯化碳0.0004%、庚烷0.5%、甲苯0.089%[8]。取9個(gè)20 mL的頂空瓶，分別加入CBT108樣品1.0 g，移取對(duì)照品溶液濃度的80%、100%和120%各3份至頂空瓶中，分別進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果如表2所示，藥典規(guī)定待測(cè)物的回收率應(yīng)在90%～110%之間，樣品測(cè)定結(jié)果均在此范圍內(nèi)，可滿(mǎn)足實(shí)際分析要求。

3.4 精密度

3.4.1 重復(fù)性 取混合對(duì)照品溶液10 mL置于20 mL頂空瓶中，密封瓶口，制備6份。按照上述色譜條件，連續(xù)注入氣相色譜儀，記錄峰面積校正值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，各組分RSD（n=6）分別為：甲醇0.8%、乙醇0.3%、乙醚2.0%、丙酮0.9%、乙腈0.6%、二氯甲烷1.8%、正己烷2.6%、乙酸乙酯1.1%、四氫呋喃1.0%、庚烷3.0%、甲苯1.4%、四氯化碳2.5%。藥典規(guī)定待測(cè)組分含量0.01%以?xún)?nèi)的重復(fù)性RSD可接受范圍為4%，上述檢測(cè)結(jié)果表明各溶劑的檢測(cè)重復(fù)性良好。

3.4.2 重現(xiàn)性 取混合對(duì)照品溶液10 mL置于20 mL頂空瓶中，密封瓶口，制備6份。分別按照上述色譜條件，連續(xù)注入氣相色譜儀，由另一名分析人員在不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)定，記錄12份樣品中的峰面積校正值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。檢測(cè)各組分RSD（n=12）分別為：甲醇1.2%、乙醇0.7%、乙醚2.2%、丙酮1.1%、乙腈1.0%、二氯甲烷2.0%、正己烷2.5%、乙酸乙酯1.3%、四氫呋喃1.2%、庚烷2.8%、甲苯1.9%、四氯化碳5.5%。藥典規(guī)定待測(cè)組分含量0.01%以?xún)?nèi)的重現(xiàn)性RSD可接受范圍為8%，檢測(cè)結(jié)果表明各溶劑的檢測(cè)重現(xiàn)性良好。

3.5 分析條件的優(yōu)化

3.5.1 色譜柱的選擇 不同極性的固定相影響待測(cè)組分的保留時(shí)間、峰形、對(duì)稱(chēng)度等重要色譜參數(shù)，待測(cè)組分的沸點(diǎn)差異也是選擇合適固定相的重要影響因素，待分離的12種組分包括極性與非極性溶劑，其中甲醇、丙酮、乙腈極性較大、沸點(diǎn)相似； 使用極性毛細(xì)管柱則易導(dǎo)致強(qiáng)極性組分保留時(shí)間短、分離不好，且強(qiáng)極性溶劑N，N-二甲基甲酰胺易干擾極性大的組分出峰； 使用非極性毛細(xì)管柱雖可減少極性影響但三者沸點(diǎn)相似易導(dǎo)致分離不好。綜合考慮上述因素，選擇對(duì)12種殘留溶劑、內(nèi)標(biāo)物與N，N-二甲基甲酰胺均分離較好的中極性色譜柱DB-624作為本研究的分析柱。

3.5.2 頂空平衡溫度及時(shí)間的選擇 頂空平衡溫度過(guò)低會(huì)影響氣-液兩相的平衡，過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致組分結(jié)構(gòu)被破壞、溶劑大量蒸發(fā)，影響結(jié)果準(zhǔn)確性。待測(cè)溶劑的沸點(diǎn)在34.6～154℃之間，藥典規(guī)定頂空平衡溫度一般應(yīng)低于溶解供試品所用溶劑的沸點(diǎn)10℃以下，且應(yīng)兼顧待測(cè)組分的沸點(diǎn)，避免供試品熱分解，故選擇頂空平衡溫度為85℃； 另外，頂空平衡時(shí)間過(guò)短會(huì)使氣-液兩相不夠達(dá)到足夠的平衡，反之會(huì)影響頂空瓶的氣密性、降低定量的準(zhǔn)確性，故選擇平衡時(shí)間為40 min； 為防止高沸點(diǎn)組分在傳輸過(guò)程中冷凝，選擇提高定量環(huán)溫度為100℃，傳輸管溫度為110℃。

3.5.3 程序升溫與分流比的選擇 由于乙醚、丙酮和三氯甲烷沸點(diǎn)較低，故選擇40℃為起始柱溫，為了防止過(guò)低的溫度導(dǎo)致峰形擴(kuò)張，出現(xiàn)拖尾，選擇將最終柱溫適當(dāng)升高以滿(mǎn)足分析要求，綜合各方面因素，升溫程序調(diào)整為40℃，保持5 min，以10℃/min升溫到260℃，保持3 min，同時(shí)為了減輕色譜柱負(fù)荷提高檢測(cè)器靈敏度，將分流比調(diào)整為25∶1。

3.5.4 溶劑的選擇 DMF、DMSO等有機(jī)溶劑沸點(diǎn)較高，用頂空時(shí)容易殘留，干擾檢測(cè)，另考慮到減少有機(jī)組分在有機(jī)溶劑中的溶解度，增加其在頂空氣體中的含量，使兩相更快平衡，選擇DMF和水組成的二元溶劑系統(tǒng)作為溶劑。

3.6 實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)3批CBT108樣品進(jìn)行了分析。在定量分析時(shí)，依據(jù)實(shí)際峰面積，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行分析，結(jié)果列于表3。樣品中可檢出甲醇、乙醇和二氯甲烷，但都低于《中華人民共和國(guó)藥典》的殘留溶劑限度值，其余溶劑均未檢出。

4 結(jié) 論

建立了新藥CBT108中12種殘留溶劑的分析方法，考察了固定相、平衡時(shí)間、升溫程序和溶劑對(duì)組分的分離影響，并驗(yàn)證了方法的可靠性與準(zhǔn)確性。本方法不僅可用于CBT108殘留溶劑的檢測(cè)，也可作為檢測(cè)其它眾多藥物殘留溶劑的方法依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)，具有良好的實(shí)際應(yīng)用與參考價(jià)值。

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