實時直接分析—質譜法快速檢測飲料和尿液中的γ—羥基丁酸

劉佳蓉 黃忠平 劉會君 王麗麗 劉春勝 任一平 史鴻鑫

摘 要 建立了一種實時直接分析-質譜法（DART-MS）用于飲料（水、碳酸飲料、啤酒）和尿液中γ-羥基丁酸（GHB）快速檢測。樣品經(jīng)甲醇-水（1∶1， V/V）溶液稀釋后，在負離子模式下，以選擇離子掃描（SIR）模式進行直接定量分析。離子化氣體溫度為 350℃，進樣速率為0.5 mm/s。針對水樣、碳酸飲料、啤酒、尿液樣品，本方法的檢出限（S/N=3）為1～2 μg/mL，定量限（S/N=10）為3～5 μg/mL。標準曲線線性相關系數(shù)為0.9899～0.9980，加標回收率為80.8%～115.2%，相對標準偏差為1.9%～12.8%。本方法具有樣品前處理簡單、分析速度快、成本低等優(yōu)點，有望在大批量飲料和尿液樣品的快速篩查分析中發(fā)揮作用。

關鍵詞 實時直接分析-質譜法；γ-羥基丁酸；快速篩查

1 引 言

γ-羥基丁酸（γ-Hydroxybutyric acid，GHB）是一種常見的濫用藥物，被用作鎮(zhèn)靜劑和麻醉劑，過度使用會造成暫時性失憶，甚至導致死亡。我國和美國都將其列為管制藥物。GHB具有強烈的鎮(zhèn)靜及健忘效應，易溶于大多數(shù)液體基質中，且無色無味，因此常作迷藥用于藥物輔助性犯罪[1]。對于服用GHB者，尿液中GHB濃度明顯高于內生濃度水平（低于10 μg/mL），因此尿液是檢測GHB極具參考價值的生物樣本，有必要建立快速靈敏的檢測飲料和尿液中GHB的方法。

目前，GHB的檢測方法有顯色法、紅外光譜法、氣相色譜-質譜聯(lián)用法、液相色譜-質譜聯(lián)用法、離子色譜法及核磁共振法等。Alston等[2]用化學顯色法作為初步篩選藥物的方法，但該方法檢出限高，且易受干擾； Witkowski等[3]采用傅里葉變換紅外法（FTIR）用于GHB的快速篩查，但定量分析存在不足； 色譜-質譜聯(lián)用是使用最廣泛的方法之一，Lenz等[4]在酸性條件下將γ-羥基丁酸（GHB）轉變?yōu)棣?丁內酯（GBL），濃縮后采用頂空進樣方式的氣相色譜-質譜聯(lián)用法（GC-MS）分析； 孟品佳等[5]用五氟卞基溴烷基化衍生后，對衍生物進行了質譜解析，然而提取和衍生化的過程復雜且耗時； Busardo等[6]采用HPLC-MS/MS法檢測血漿、尿液、腦脊髓液和頭發(fā)中的GHB，盡管避免了GC-MS中將GHB進行內酯化或者衍生化的樣品前處理問題，但仍然需要耗時的色譜分離，且使用的串聯(lián)質譜價格昂貴，不利于推廣。Liu等[7]采用二維離子色譜法測定了人尿樣品中GHB含量，通過離子排斥色譜柱消除尿液基質干擾，再利用柱切換技術，采用離子交換色譜柱測定GHB，由于需要對儀器進行改裝，且使用實驗室自制離子交換色譜柱，不利于推廣。Palomino-Schtzlein等[8]利用核磁共振對尿液和血清中的GHB進行定性和定量檢測，在NMR分析中，體液中大分子重疊共振，嚴重干擾了GHB的檢測。Saar-Reismaa等[9]利用毛細管電泳法測定人唾液樣本中的GHB，但毛細管電泳中電滲流的不穩(wěn)定性經(jīng)常引起遷移時間的變化。

實時直接分析離子源（DART）是一種新型的敞開式非表面接觸型解析/離子化分析技術，可分析各形態(tài)樣品，無需繁雜的前處理和冗長的色譜分離過程，分析速度為秒級，可實現(xiàn)對目標物的實時定性與定量分析[10]。Bennett等[11]將DART與飛行時間質譜儀（TOF）聯(lián)用，檢測飲料中GHB； Chen等[12]將DART與四極桿-軌道離子阱質譜（Q-Orbitrap）聯(lián)用，用于檢測包括GHB在內的多種街頭藥物。但上述工作均未進行GHB的準確定量分析，且未涉及尿液樣本的檢測； 同時，飛行時間質譜和四極桿-離子阱質譜比單四極桿質譜價格昂貴，測試成本高，不利于普及使用。

本研究采用實時直接分析-單四極桿質譜法，建立了快速檢測飲料及尿液中的GHB的方法。本方法無需復雜的樣品前處理過程，分析速度快，且單重四極桿質譜成本相對較低，體積小，更易于推廣，飲料及尿液樣本的同時測定更利于刑事案件的偵查。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

實時直接分析離子源DART SVP（美國Ion Sense公司）； ACQUITY QDa質譜檢測器（美國Waters公司）； 3K15離心機（德國Sigma公司）、UPR-II-5T超純水儀（四川優(yōu)普超純科技有限公司）、VX-200渦旋攪拌器（美國Labnet公司）、AR223CN電子天平（美國Ohaus公司）、KH7200DB型超聲儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

甲醇（色譜純，德國 Merck 公司），實驗用水為經(jīng)UPR-II-5T超純水儀制備的超純水； γ-羥基丁酸（美國Cerilliant公司）。3種飲料樣品購于當?shù)爻?，分別為水、無色碳酸飲料和啤酒； 尿液樣品由志愿者提供。

2.2 溶液配制

稱取GHB標準品0.01 g （精確到0.001 g），以超純水溶解并定容至10 mL，配制成1000 μg/mL的單標儲備液，于4℃保存。使用前以甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋成不同濃度的標準溶液。

碳酸飲料、啤酒的標準溶液：取碳酸飲料和啤酒各10 μL，加入適量標準儲備液，用990 μL甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋成不同濃度的標準溶液。

模擬樣品的配制： 在空白樣品中添加適量的標準溶液，制得不同濃度的陽性樣品。配制的模擬水樣中GHB濃度約為20、40和80 μg/mL，以甲醇稀釋1倍后進樣； 碳酸飲料和啤酒中GHB濃度約為1000、2000和4000 μg/mL，以甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋100倍后進樣； 尿液中GHB濃度約為200 μg/mL， 以甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋10倍后進樣。

2.3 樣品前處理

飲料：水樣取500 μL，加入500 μL甲醇，過0.22 μm濾膜后進樣； 對于碳酸飲料和啤酒，取10 μL樣品，加入990 μL甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后檢測。

尿樣：取尿樣100 μL，加900 μL甲醇-水（1∶1， V/V），渦旋混勻，以10000 r/min離心5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后檢測。

2.4 實時直接分析離子源條件和質譜條件

負離子模式采集數(shù)據(jù)，離子化氣體為高純氦氣，氦氣的流速為3 L/min，氣體離子化溫度為350℃； 采用12 Dip-it Samplers 模式進樣，用玻璃棒蘸取適量溶液置于自動進樣架上，待溶液揮干后進樣，進樣速率為0.5 mm/s，柵極電壓為200 V， 離子源出口距質譜進口約2.4 cm。在負離子模式下，選擇離子掃描模式（SIR）采集數(shù)據(jù)，錐孔電壓為8 V，母離子m/z 103.3。

3 結果與討論

3.1 質譜條件的優(yōu)化

在選擇離子掃描模式下，分別采用正離子模式和負離子模式對GHB進行一級質譜分析，得到其分子離子峰。如圖1所示，GHB在正負離子模式下均有響應，但在負離子模式下GHB的信號強度明顯優(yōu)于正離子模式，因此本研究選擇負離子模式進樣。在此條件下，優(yōu)化錐孔電壓，使分子離子峰達到最大響應值，最終確定錐孔電壓為8 V。

3.2 DART條件的優(yōu)化

3.2.1 離子化溫度 DART利用高溫激發(fā)態(tài)的等離子體對待測樣品進行解吸離子化，因此離子化溫度是需要優(yōu)化的重要參數(shù)。溫度過高或過低，都會影響DART的離子化效率和背景噪音。高溫會加速待測樣品的熱解吸率，使更多的待測樣品進入質譜檢測器，進而增強響應。然而，過高的溫度會導致待測樣品在熱解吸過程中降解，降低靈敏度[13]。本研究考察了離子化氣體溫度在300～450℃范圍內對GHB離子化效率的影響，發(fā)現(xiàn)離子化溫度為350℃時，信號響應最高，如圖2所示。

3.2.2 樣品傳輸速度 DART軟件能控制線性軌道上dip-it玻璃棒的移動速度，玻璃棒蘸取待測樣品后引入質譜儀分析。玻璃棒通過電離區(qū)域的速度對樣品信號響應強度有較大的影響。本研究考察了樣品傳輸速度為0.2、0.5和0.8 mm/s時GHB的峰形和離子響應強度。如圖3所示，當樣品傳輸速度較慢時，有利于離子化氣體與樣品充分接觸，從而提高離子化效率，但峰形變寬。綜合考慮峰形、分析速度及離子響應強度等因素，最終確定以0.5 mm/s的速度進行樣品傳輸。

3.3 方法學考察

水樣的基質較為簡單，用甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋1倍后直接進行分析。碳酸飲料和啤酒的基質成分較復雜，在制作標準曲線時應考慮基質效應?；|效應的評價公式為：基質效應=（1-基質空白溶液的加標信號強度/空白溶劑的加標信號強度） ×100%[14]。經(jīng)計算碳酸飲料和啤酒的基質效應>15%，故以空白碳酸飲料和啤酒為溶劑配制一系列不同濃度的GHB標準溶液。由于碳酸飲料中含有較多的糖類，樣品黏度大，而啤酒中的成分較為復雜，基質濃度過高時，樣品液膜太厚，可能無法實現(xiàn)目標分析物的瞬間氣化，直接進樣后得到的選擇離子流圖出現(xiàn)了裂峰現(xiàn)象。本實驗采用甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋碳酸飲料和啤酒樣品，考察稀釋倍數(shù)（10、20、50和100倍）對峰形及信號響應的影響。結果表明，稀釋100倍后直接進樣可以消除選擇離子流圖的裂峰現(xiàn)象。

尿液樣品通過甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋10倍后進樣，結果表明，尿液的基質效應小于15%，屬于低基質效應影響，故在實際定量分析過程中采用與水樣相同的標準曲線。

飲料（水、碳酸飲料、啤酒）和尿液的工作曲線方程如表1所示，其線性范圍均為5～100 μg/mL，線性相關系數(shù)R>0.98，方法的相對標準偏差為4.1%～5.7%，檢出限（S/N=3）為1.0～2.0 μg/mL，定量限（S/N=10）為3.0～5.0 μg/mL。

3.4 模擬樣品分析

在實際的刑事案件中，飲料中GHB的濃度范圍在1.7～21.1 mg/mL之間[11]。由于陽性的實際樣品難以獲取，本實驗通過加標的方式配制模擬陽性樣品。在適量飲料樣品中添加GHB標準品，使飲料中GHB的含量分別約為1000、2000和4000 μg/mL。對于刑事案件中的尿液樣品，Bosman等[15]報道在疑似藥物服用的不同案件中尿液樣品中GHB濃度范圍為14～2000 μg/mL。LeBeau等[16]也報道了一例疑似藥物輔助性犯罪（DFSA）案件中，尿液中GHB的濃度為308 μg/mL。采用在陰性尿液中添加GHB標準品的方式配制模擬陽性尿液樣品，使尿液中GHB的含量約為200 μg/mL。按照2.3節(jié)的方法對上述配制的模擬樣品進行簡單前處理后，進行檢測。

稀釋后的模擬陽性樣品測得的質譜圖見圖4，測得的GHB濃度如表2所示。加標回收率在80.8%～115.2%之間，相對標準偏差為1.9%～12.8%，表明本方法具有較好的準確度和重現(xiàn)性。

4 結 論

本研究建立了一種飲料和尿液中快速篩查GHB的DART-MS方法，樣品前處理過程簡單快速，操作方便，可對實際飲料樣品（水、碳酸飲料、啤酒）以及尿液中的GHB進行快速篩查，且DART-MS儀器成本低，體積小。本方法可應用于現(xiàn)場快速檢測，可為司法鑒定中涉及GHB的案件提供技術支持。

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