錦鯉廈門希瓦氏菌的分離鑒定及藥敏試驗

苗淼 呂愛軍 胡秀彩 韓卓然 王景桂 陳成勛 孫敬鋒

摘要：【目的】明確引起錦鯉發(fā)病死亡的原因及其病原菌的藥敏特性，為生產(chǎn)中有效防治該病提供科學依據(jù)?！痉椒ā坎捎贸Ｒ?guī)方法從患病錦鯉的肝臟中分離病原菌，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析確定其種屬，通過人工感染試驗判斷病原菌的致病性，并以紙片擴散法測定其藥物敏感性?！窘Y果】綜合分離菌株的形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析結果，可確定其為廈門希瓦氏菌。人工感染試驗證明，從患病錦鯉肝臟分離獲得的廈門希瓦氏菌具有較強毒力，其對斑馬魚的半數(shù)致死量（LD₅₀）為2.30x0⁴CFU/mL。廈門希瓦氏菌對阿莫西林、紅霉素、頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、美羅培南、亞胺培南、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素和氟苯尼考等14種藥物高度敏感，但對氨芐西林、左氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、利福平、鏈霉素、依諾沙星、磺胺異惡唑和甲氧嘧啶等抗生素已產(chǎn)生耐藥性。【結論】廈門希瓦氏菌可感染引起錦鯉發(fā)病死亡，且具有較強毒力，實際生產(chǎn)中可選用阿莫西林、美羅培南、亞胺培南、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、頭孢哌酮、頭孢克肟、頭孢噻肟和阿奇霉素等抗生素進行防治。

關鍵詞：錦鯉；廈門希瓦氏菌；分離鑒定；生理生化特性；藥敏試驗

0引言

【研究意義】錦鯉（Cyprinus carpio var.Koi）又稱緋鯉，隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprini-dae），是一種亞熱帶淡水觀賞魚，其體色艷麗、體格健美、泳姿優(yōu)美，具有極高的觀賞價值。隨著社會經(jīng)濟不斷發(fā)展和人民生活水平的提高，錦鯉在國內已擁有廣闊的市場，但因育苗工廠化快速發(fā)展過程中養(yǎng)殖密度過大而造成其患病率和死亡率居高不下，嚴重制約了錦鯉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。當前，錦鯉皰疹病等病毒性疾病仍是造成其死亡的重要原因，且細菌性疾病發(fā)生日益頻繁，如銅綠假單胞菌、少動鞘氨醇單胞菌、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌（李梅等，2010；辛偉濤等，2011；姜娜等，2012；陳凱等，2015）等均可引起錦鯉不同程度的發(fā)病死亡。因此，加強錦鯉的病理學研究對確保其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】希瓦氏菌屬（Shewanella）是1985年MacDonell和Colwell根據(jù)5srRNA序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析后建立的新屬，為革蘭氏陰性桿菌，主要腐敗魚、蝦類等海產(chǎn)品。廈門希瓦氏菌（S.xiamenensis）隸屬于希瓦氏菌屬，從我國福建省廈門沿海的海洋沉積物中首次分離獲得（Huang et al，2010），此后又在一位胰腺炎患者術后放置的胰周引流管中檢測出廈門希瓦氏菌（zong，2011）。廈門希瓦氏菌分布廣泛，不僅分布在水體沉積物中，還廣泛存在于淡水、海水和污水中（Huanget al，2010）。目前，國內外已有希瓦氏菌引起水產(chǎn)動物發(fā)病的研究報道，包括海藻希瓦氏菌（S algae）和腐敗希瓦氏菌，尤其是腐敗希瓦氏菌已被證實不僅可感染海水魚類如金帶藍子魚也能感染淡水養(yǎng)殖魚類如鯉魚和鱒魚。秦蕾等（2012）首次從患病異育銀鯽的體表病灶和內臟中分離鑒定出腐敗希瓦氏菌，推測腐敗希瓦氏菌作為一種潛在的新病原也會對異育銀鯽養(yǎng)殖造成威脅。此外，周康等（2015）通過建立鯉魚腐敗希瓦氏菌的生長動力學模型，發(fā)現(xiàn)以Baranyi模型的預測效果最佳，能有效地進行食品安全預警；郭全友等（2016）探討了環(huán)境因子對大黃魚腐敗希瓦氏菌生長計數(shù)分析的影響，結果表明，平板計數(shù)法和濁度法均可對腐敗希瓦氏菌生長/非生長進行有效判斷，但環(huán)境因子強度較大時宜采用平板計數(shù)法。【本研究切入點】隨著錦鯉市場需求量的增長和養(yǎng)殖工廠化程度的提高，其病害發(fā)生日趨頻繁，尤其是細菌性疾病（李梅等，2010；辛偉濤等，2011；姜娜等，2012；陳凱等，2015）已成為制約錦鯉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一，但至今鮮見廈門希瓦氏菌引起錦鯉發(fā)病死亡的相關報道?！緮M解決的關鍵問題】2017年6月天津市某錦鯉養(yǎng)殖場的魚群出現(xiàn)大批量發(fā)病死亡現(xiàn)象，且各年齡段錦鯉均有發(fā)病，給養(yǎng)殖戶造成巨大經(jīng)濟損失。因此，亟需對患病錦鯉進行病原分離鑒定和致病性分析。在常規(guī)微生物分類鑒定的基礎上，采用16S rDNA序列分析進行分子生物學鑒定，并通過藥敏試驗篩選敏感藥物，旨在為生產(chǎn)中有效防治該病提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

患病錦鯉取自天津某錦鯉養(yǎng)殖場；人工感染試驗所用的斑馬魚購白天津市中環(huán)花鳥魚蟲市場，體長3.24±0.5 cm，體重0.354±0.10g。營養(yǎng)瓊脂、胰蛋白胨和酵母提取物購自北京奧博星生物技術有限公司；細菌微量生化鑒定管及配套試劑購自杭州微生物試劑有限公司；藥敏紙片購自杭州濱河微生物試劑有限公司，試驗用抗生素：阿莫西林（10μg/片）、氨芐西林（10μg/片）、紅霉素（15μg/片）、頭孢克肟（5μg/片）、頭孢哌酮（75μg/片）、頭孢噻肟（30μg/片）、頭孢氨芐（5μg/片）、美羅培南（10μg/片）、亞胺培南（10μg/片）、萬古霉素（30μg/片）、阿米卡星（30μg/片）、慶大霉素（10μg/片）、卡那霉素（30μg/片）、鏈霉素（10μg/片）、新霉素（30μg/片）、阿奇霉素（15μg/片）、克林霉素（2μg/片）、四環(huán)素（30μg/片）、左氧氟沙星（5μg/片）、萘啶酸（30μg/片）、諾氟沙星（30μg/片）、恩諾沙星（5μg/片）、氯霉素（30μg/片）、呋喃妥因（300μg/片）、利福平（5μg/片）、依諾沙星（10μg/片）、氟苯尼考（30μg/片）、磺胺異亞唑（300μg/片）、甲氧嘧啶（5μg/片）和復方新諾明（1.25/23.75μg/片）。

1.2病原菌分離

選取患病癥狀明顯的錦鯉在無菌條件下解剖，取其肝臟，剪碎后在LB固體培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂330g/L，NaCl 1 mol/L，pH 7.0～7.2）上劃線，28℃培養(yǎng)18h；挑選單個優(yōu)勢菌落接種至新的LB固體培養(yǎng)基上，28℃再培養(yǎng)18h，純化獲得的純種菌株命名為JLR。同時將純化后的菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)18 h后與40%甘油按1：1的比例進行混合，混勻后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3病原菌分類鑒定

1.3.1形態(tài)觀察及生理生化鑒定JLR菌株在LB固體培養(yǎng)基上（294±1）℃培養(yǎng)16h后進行革蘭氏染色觀察；生理生化特性采用細菌微量生化鑒定管對JLR菌株進行各項生理生化指標測定，具體操作參照細菌微量生化鑒定管使用說明。

1.3.2 16S rDNA序列分析采用水煮法提取JLR菌株的DNA（馮廣達等，2013），并以此為DNA模板進行16S rDNA序列PCR擴增，其通用上游引物為27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物為1492r：5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應體系20.0μL，包括2xMaster Mix 10.0μL，上、下游引物各1.0μL，DNA模板1.0μL，無菌雙蒸水7.0μL。擴增程序：94℃預變性5 min；94℃30 s，55℃30 min，72℃90 s，進行30個循環(huán)；72℃延伸10 min。以1.0%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，然后送至金維智生物科技（北京）有限公司測序。測序結果在GenBank中進行BLAST比對分析，并從比對結果中挑選出與之相關的種屬菌株序列，采用MEGA 5.0進行多序列匹配分析，最后以鄰位相連法（Neighbor-ioining method）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.4人工感染試驗

選取游動快速、反應敏捷的斑馬魚60尾，于（25±2）℃、pn 6.7-7.3的水箱中暫養(yǎng)1周，養(yǎng)殖期間連續(xù)供氧，試驗前1d停止喂食。感染試驗在25 cmx15cmx5cm的塑料魚槽中進行，具體操作參照呂愛軍等（2011）、胡秀彩等（2012）的方法：先以LB液體培養(yǎng)基培育JLR菌懸液[（29±1）℃，16h）]，獲得的菌懸液在4℃下2000 r/min離心10 min，棄上清液，加入0.89%NaCl進行稀釋，調整菌懸液濃度。感染試驗設6個處理組（1個對照組和5個試驗組），5個試驗組對應的菌懸液濃度分別為3.68x10⁷、3.68x10⁶、3.68x10⁵、3.68x10⁴和3.68x10³CFU/mL，每尾腹腔注射10.0μL；對照組注射等量生理鹽水（0.89%NaCl）。試驗期間不喂食，每天觀察和記錄魚體發(fā)病情況，及時撈出死亡個體，連續(xù)觀察7 d。按1.2的方法對死亡魚體進行病原菌分離，并采用BLISS方法計算菌株對斑馬魚的半數(shù)致死量（LDso）。

1.5藥敏試驗

采用紙片擴散法對JLR菌株的藥物敏感性進行檢測，然后根據(jù)藥敏紙片的抑菌范圍標準進行結果判定（饒穎竹等，2016）。

2結果與分析

2.1患病錦鯉的癥狀表現(xiàn)

發(fā)病初期，病魚游動緩慢，攝食量減少，有浮頭現(xiàn)象；病魚體表充血，眼球凹陷，肛門兩側肌肉糜爛，胸鰭和尾鰭均有出血點，魚鰓充血發(fā)紅（圖1）。

2.2 JLR菌株的形態(tài)特征及生理生化特性

JLR菌株經(jīng)LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后可觀察到淡褐色的圓形菌落，邊緣整齊，中央輕微凸起，表面光滑，不透明；其菌體革蘭氏染色呈陰性，無芽孢，短桿狀（圖2）。JLR菌株的生理生化鑒定結果（表1）表明，其氧化酶反應、接觸酶反應和硝酸鹽還原反應呈陽性，M.R.試驗、V-P試驗和苯丙氨酸反應呈陰性；無動力；可發(fā)酵利用葡萄糖（O-F發(fā)酵型），但不能利用棉籽糖、木糖、山梨醇、側金盞花醇和檸檬酸鹽；可發(fā)酵產(chǎn)生硫化氫及鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶，但不產(chǎn)生吲哚，即JLR菌株的生理生化特性與廈門希瓦氏菌高度相似。

2.3 16S rDNA序列分析結果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在1500 bp附近出現(xiàn)單一清晰的目的條帶（圖3），其測序結果顯示，JLR菌株的16S rDNA序列長度為1484 bp，與預期結果一致。經(jīng)BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)JLR菌株與廈門希瓦氏菌的同源性在99.0%以上。從基于16SrDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖4）也可看出，JLR菌株與廈門希瓦氏菌（HQ418493）聚為一支，即二者的親緣關系最近。

綜合JLR菌株的形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析結果，可確定其為廈門希瓦氏菌（S.xiamenensis）。

2.4人工感染試驗結果

由表2可知，菌懸液濃度為3.68x10⁷和3.68x10⁶CFU/mL兩個試驗組的斑馬魚在攻毒后48 h內全部死亡，3.68x10³CFU/mL試驗組斑馬魚在攻毒后7d內的累積死亡率為70%，對照組的斑馬魚在整個試驗期間均未出現(xiàn)病理變化和死亡現(xiàn)象。采用BLISS方法計算得知，JLR菌株對斑馬魚的LD₅₀為2.30x10⁴CFU/mL。發(fā)病初期斑馬魚游動緩慢或沉于水底，體表有明顯出血癥狀；從死亡斑馬魚的內臟團中可分離出與JLR菌株形態(tài)特征和生理生化特性一致的優(yōu)勢菌株。

2.5藥敏試驗結果

由表3可知，JLR菌株對阿莫西林、紅霉素、頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、美羅培南、亞胺培南、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素和氟苯尼考等14種藥物高度敏感，對頭孢氨芐、萬古霉素、四環(huán)素、呋喃妥因和阿米卡星等5種抗生素中度敏感，對氨芐西林、左氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、利福平、鏈霉素、依諾沙星、磺胺異惡唑和甲氧嘧啶等抗生素已產(chǎn)生耐藥性。

3討論

希瓦氏菌是海淡水養(yǎng)殖環(huán)境中常見的細菌類群，目前有關希瓦氏菌感染淡、海水魚類的研究報道較多，但感染廈門希瓦氏菌的案例很少。廈門希瓦氏菌與奧奈達希瓦氏菌（S.oneidensis）的親緣關系最近，與腐敗希瓦氏菌也具有一定的親緣關系（秦蕾等，2012）。從希瓦氏菌的生理生化特性來看，奧奈達希瓦氏菌可將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽和一氧化氮，表現(xiàn)出過氧化氫酶活性（Venkateswaran et al，1999）。腐敗希瓦氏菌的氧化酶和接觸酶反應呈陽性，可發(fā)酵產(chǎn)生鳥氨酸脫羧酶，但不產(chǎn)生脲酶；不發(fā)酵葡萄糖、山梨醇、棉籽糖、側金盞花醇和木糖；V-P試驗和M.R.試驗呈陰性；能利用檸檬酸鹽，產(chǎn)硫化氫但不產(chǎn)吲哚（Kozifiska and Pekala，2004；Holt et al，2005；秦蕾等，2012）。本研究從患病錦鯉的肝臟中分離獲得廈門希瓦氏菌，其與腐敗希瓦氏菌和奧奈達希瓦氏菌相比，最明顯的區(qū)別是廈門希瓦氏菌可利用葡萄糖。

藥敏試驗可為疫病防治的科學用藥提供重要參考依據(jù)，但實際用藥時需嚴格執(zhí)行國家有關漁藥使用的規(guī)定及政策，避免抗生素濫用及違禁藥物的使用，防止病原菌產(chǎn)生耐藥性（陳凱等，2015；饒穎竹等，2016）。錦鯉廈門希瓦氏菌的藥敏試驗結果表明，其對阿莫西林、紅霉素、頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、美羅培南、亞胺培南、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素和氟苯尼考等14種藥物高度敏感，但對氨芐西林、左氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、利福平、鏈霉素、依諾沙星、磺胺異惡唑和甲氧嘧啶等抗生素已產(chǎn)生耐藥性。雖然部分抗生素如紅霉素、氯霉素、左氧氟沙星等在養(yǎng)殖過程中已經(jīng)禁用，但對廈門希瓦氏菌的抗菌譜研究及其分類地位鑒定仍具有重要指導意義。廈門希瓦氏菌對亞胺培南、美羅培南、頭孢菌素等抗生素高度敏感，與希瓦氏菌屬對大部分β-內酰胺類抗生素較敏感的觀點相符（Sivolodskil et al，2012）。此外，廈門希瓦氏菌對萘啶酸、利福平、恩諾沙星和左氧氟沙星等抗生素不敏感，但秦蕾等（2012）研究發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌對這些抗生素較敏感，具體原因有待進一步探究。

本研究的人工感染試驗結果表明，廈門希瓦氏菌具有較強毒力，其對斑馬魚的LD₅₀為2.30x10⁴CFU/mL，說明廈門希瓦氏菌作為一種條件性致病菌會對錦鯉養(yǎng)殖造成巨大威脅。尤其是養(yǎng)殖過程中，當養(yǎng)殖密度過大或水體污染時，魚體因逆境脅迫而造成機體抵抗力下降，此時為致病菌的入侵創(chuàng)造了有利條件，進而導致魚體感染發(fā)病甚至大量死亡。該結論為進一步研究廈門希瓦氏菌的多樣性及分子生物學特性打下了基礎。

4結論

廈門希瓦氏菌可感染引起錦鯉發(fā)病死亡，且具有較強毒力，實際生產(chǎn)中可選用阿莫西林、美羅培南、亞胺培南、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、頭孢哌酮、頭孢克肟、頭孢噻肟和阿奇霉素等抗生素進行防治。