PRRSV誘導(dǎo)豬體內(nèi)肺泡巨噬細(xì)胞炎癥模型的建立

羅文涓 楊劍 敖妙 劉妍璨 覃一峰 文露婷 黎江 韋英益　胡庭俊

摘要：【目的】建立豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）誘導(dǎo)體內(nèi)豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）炎癥模型，評價PRRSV感染對仔豬免疫系統(tǒng)的影響，為豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的臨床診斷及科學(xué)防控提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳訮RRSV-GXNN1396株人工感染30日齡健康斷奶仔豬，復(fù)制出PRRS病癥，剖殺后采集病料，通過組織病理學(xué)和RT-PCR檢測觀察各免疫器官組織的病理變化及其病毒分布情況，并檢測PAM細(xì)胞內(nèi)的COX-1、COX-2等酶活性變化及IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、IFN-y、MCP-1和TNF-a等炎性細(xì)胞因子水平變化?！窘Y(jié)果】斷奶仔豬接種PRRSV-GXNN1396株后第3d開始表現(xiàn)出典型的PRRS病癥，PRRSV主要集中在肺臟、頜下淋巴結(jié)、血液和扁桃體等樣品組織中，攻毒仔豬各主要器官的實質(zhì)細(xì)胞及有關(guān)淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度壞死和炎癥細(xì)胞浸入現(xiàn)象，尤其以肺臟、腎臟、脾臟等器官受損嚴(yán)重，出現(xiàn)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。PRRSV感染早期（第3d）仔豬PAM細(xì)胞中的ROS水平及COX-2、IL-6、IL-8、TL-10和TNF-a等因子水平均呈升高趨勢，且COX-2、IL-6、IL-8和TNF-a因子水平極顯著升高（P<0.01）；隨著感染天數(shù)的增加，PAM細(xì)胞內(nèi)的COX-2、IL-6和IL-8因子水平呈下降趨勢，TNF-a因子水平呈上升趨勢。【結(jié)論】成功建立了PRRSV誘導(dǎo)仔豬體內(nèi)PAM細(xì)胞炎癥模型，進(jìn)一步佐證PRRSV主要侵害豬的免疫器官組織，以達(dá)到免疫抑制的效果，并推斷感染第3d是病豬炎癥反應(yīng)的高峰期。

關(guān)鍵詞：豬；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）；肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）；炎癥模型；炎性細(xì)胞因子

0引言

【研究意義】豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）隸屬于尼多病毒目（Nidovirale）、動脈炎病毒科（Ar-teriviridae）、動脈炎病毒屬（Arterivirus），為單股正鏈RNA病毒；PRRSV感染能引起妊娠母豬晚期流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎及新生仔豬和生長豬出現(xiàn)呼吸障礙或死亡（張華等，2016）。肺泡巨噬細(xì)胞（Pulmo-nary alveolar macrophages，PAM）是影響宿主免疫系統(tǒng)重要的免疫細(xì)胞，也是PRRSV感染最主要的靶細(xì)胞，即PRRSV感染可導(dǎo)致PAM細(xì)胞的免疫功能受到抑制（Lunney et al，2016；焦文強(qiáng)等，2017）。因此，研究豬群感染PRRSV后PAM細(xì)胞不同時間段胞內(nèi)炎性細(xì)胞因子的變化規(guī)律，對揭示PRRSV感染宿主的致病機(jī)制具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】PRRSV在全球大部分地區(qū)流行，是目前危害養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一（黎源強(qiáng)，2014；高延娜等，2016；焦文強(qiáng)等，2017），而PRRSV如何介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及其調(diào)控的分子機(jī)制已成為研究熱點。李傳民等（2014）利用不同濃度的PRRSV感染PAM細(xì)胞，并在不同時間點檢測干擾素y誘導(dǎo)蛋白30基因（IFI3D）的表達(dá)情況，結(jié)果表明，IFI30基因在PRRSV感染PAM細(xì)胞過程中的表達(dá)變化規(guī)律可能是PRRSV與宿主相互作用的機(jī)制之一。王超（2015）研究證實，PRRSV感染激活NL-RP3炎癥小體并產(chǎn)生IL-1β等促炎性細(xì)胞因子抵御病毒入侵和保護(hù)機(jī)體，同時編碼能拮抗NLRP3炎癥小體活化的蛋白——nsp11和nspla，以抑制炎癥發(fā)生，從而使其能在宿主體內(nèi)持續(xù)增殖。余志彬（2016）研究發(fā)現(xiàn)PRRSV感染可誘導(dǎo)IL-12p40和IL-12p35表達(dá)，其中，PRRSV對IL-12p40的誘導(dǎo)依賴于JNK-AP-1和NF-KB信號途徑，而對IL-12p35的誘導(dǎo)依賴于p38 MAPK和PKC信號通路。張玲等（2016）研究表明，PRRSV能引起強(qiáng)烈的肺部病理學(xué)變化和病毒血癥，且與IL-1β、IL-6、TNF-a等炎性細(xì)胞因子存在一定關(guān)聯(lián)。夏天奇等（2017）研究表明，PRRSV感染PAM細(xì)胞體外誘導(dǎo)IL-10表達(dá)水平的差異可能是其誘導(dǎo)p38 MAPK磷酸化水平差異所致?！颈狙芯壳腥朦c】明確PRRSV誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是揭示其致病和免疫機(jī)制的關(guān)鍵，但目前以PRRSV感染仔豬建立體內(nèi)PAM細(xì)胞炎癥模型的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以PRRSV-GXNN1396株感染健康斷奶仔豬，通過組織病理學(xué)和RT-PCR檢測觀察各免疫器官組織的病理變化及其病毒分布情況，并檢測PAM細(xì)胞內(nèi)的COX-1、COX-2等酶活性變化及IL-6、IL-8、TL-10、IL-1B、WN-y、MCP-1、TNF-a等炎性細(xì)胞因子水平變化，評價PRRSV感染對仔豬免疫系統(tǒng)的影響，為豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的臨床診斷及科學(xué)防控提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

PRRSV-GXNNl396株（P3）由廣西大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室提供，經(jīng)Marc-145細(xì)胞（猴胚胎腎上皮細(xì)胞）增殖后獲得PRRSV-GXNNl396株，其病毒滴度為4x10⁴/0.1 mL；Marc-145細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實驗室保存提供；30日齡健康斷奶仔豬購自廣西南寧上方牧業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)RT-PCR/PCR和ELISA檢測PRRSV/PCV-2抗體及抗原均呈陰性；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；COX-1、COX-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1B、WN-y，MCP-1和TNF-a等檢測試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司，XOD、ROS和MPO等檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。主要儀器設(shè)備：UV1750型紫外分光光度計、Multimode PlateReader多功能酶標(biāo)儀、S1000梯度PCR儀、C150細(xì)胞培養(yǎng)箱和TS100-F倒置顯微鏡等。

1.2試驗方法

1.2.1試驗分組及處理將12頭30日齡健康斷奶仔豬隨機(jī)分為兩組，其中，攻毒組經(jīng)滴鼻感染/頭頸部肌肉注射（2.0 mL/頭），病毒量為4x10⁴TCID₅₀的PRRSV-GXNN1396株，空白對照組感染等劑量RPMI-1640。接種后每天觀察仔豬的臨床表現(xiàn)，測定體溫和體重變化。

1.2.2病毒核酸檢測于感染后第2 d（攻毒48 h），采集供試仔豬血清、鼻拭子、肛門拭子進(jìn)行病毒檢測，確定仔豬是否感染PRRSV。剖殺后采集PAM細(xì)胞、血清、鼻拭子、肛門拭子及各組織器官，采用RT-PCR進(jìn)行病毒檢測，具體操作參照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明。

1.2.3組織病理學(xué)觀察采集試驗仔豬的頜下淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、胸腺、肺臟、心臟、肝臟、脾臟、腎臟和扁桃體等器官組織，以10%甲醛固定，按常規(guī)流程制備石蠟切片，經(jīng)HE染色后進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.4炎性細(xì)胞因子水平檢測

經(jīng)前腔靜脈采血后，頸靜脈放血致死試驗仔豬。無菌解剖，剝離氣管并用無菌棉線結(jié)扎，取出完整肺臟，用無菌PBS充分沖洗肺臟表面，清除血漬和污物，用滅菌手術(shù)剪剪斷結(jié)扎的氣管，移液管吸取PBS灌入肺臟使其充盈，用手輕捏揉肺葉數(shù)次后，收集肺臟中的液體，重復(fù)灌洗多次；收集的液體過200目濾篩后分裝于50.0 mL離心管中，4℃下2000 r/min離心10 min；用10%RPMI-1640稀釋后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)節(jié)其濃度至1x10⁸/mL，超聲波破碎分裝后立即進(jìn)行檢測或-80℃保存?zhèn)溆?。血樣常溫靜置2h后8000r/min離心3 min，取上清液分裝檢測或-80℃保存?zhèn)溆?。ROS水平采用熒光探針進(jìn)行測定，NO含量采用Griess法測定，GSH含量采用酶標(biāo)法測定，XOD、MPO和iNOS活性采用分光光度法測定，COX-1、COX-2、IL-6、IL-8、TL-10、IL-1B、IFN-y、MCP-1和TNF-a因子水平采用ELISA試劑盒進(jìn)行測定。

1.3統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2結(jié)果與分析

2.1攻毒仔豬的臨床癥狀

斷奶仔豬接種PRRSV-GXNN1396株后第3 d開始表現(xiàn)出典型的PRRS病癥，體溫上升到40.0℃以上，食欲不振，精神沉郁，尿黃，部分病豬伴有流清鼻涕和呼吸困難癥狀；攻毒后5～6 d仔豬出現(xiàn)輕微腹瀉，體溫持續(xù)性升高，眼部結(jié)膜炎，部分仔豬可見耳部、體表皮膚微發(fā)紫等癥狀?？瞻讓φ战M仔豬未見異常癥狀。

2.2病毒分布情況

攻毒后48 h進(jìn)行前腔靜脈采血，并剖殺仔豬采集鼻拭子、肛門拭子及器官組織病料，分批次進(jìn)行RNA抽提，檢測仔豬感染PRRSV情況，結(jié)果顯示，從攻毒組仔豬的血樣及各種病料組織均能檢測到PRRSV核酸，而空白對照組仔豬未檢測出PRRSV核酸。對比各病料樣品中的PRRSV核酸含量，發(fā)現(xiàn)其主要集中在肺臟、頜下淋巴結(jié)、血液和扁桃體等樣品組織中，即PRRSV主要集中在宿主的免疫器官。

2.3器官組織病理變化

通過剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組仔豬的器官組織未見異常病理變化，而攻毒組仔豬出現(xiàn)PRRSV感染的典型病理變化，且病變主要集中在肺臟和淋巴結(jié)等免疫器官組織。由圖1可看出，攻毒組仔豬出現(xiàn)明顯的纖維性胸膜炎、腹膜炎及心包炎，其胸腔、腹腔出現(xiàn)大量積液，伴有惡臭味；心臟被膜也出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥，有黏著感及大量心包積液；頜下淋巴結(jié)及腹股溝淋巴結(jié)周圍出現(xiàn)大量大小不一的乳白色結(jié)節(jié)；肺臟呈間質(zhì)增生性肺炎，其隔葉呈大面積嚴(yán)重的“肉樣變”，且伴有不同程度的出血點，個別仔豬的整個肺臟呈暗紅色，出現(xiàn)分布較均勻的“肉樣變”及出血點，肺小葉間隔增寬，嚴(yán)重水腫。

與空白對照組仔豬進(jìn)行對比，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)攻毒組仔豬肺部呈特征性的間質(zhì)性肺炎病變，其尖葉、心葉和膈葉均出現(xiàn)明顯的暗紅色“肉樣變”區(qū)域，有出血點、腫大和問質(zhì)增寬；腎臟呈褐色或土黃色，質(zhì)地較脆，未見明顯腫脹；脾臟輕微腫脹，無明顯病變；肝臟輕微腫大、淤血；心臟出現(xiàn)心包炎，心冠脂肪呈膠凍樣；扁桃體輕微充血、出血；腸系膜、頜下和腹股溝等處的淋巴結(jié)腫大、輕微出血。

2.4病理組織切片觀察結(jié)果

于攻毒后第3和6d分別剖殺試驗仔豬，并采集脾臟、腎臟、肝臟等器官組織制作病理切片，經(jīng)HE染色，觀察其病理變化。結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，空白對照仔豬的器官組織結(jié)構(gòu)均未出現(xiàn)異常變化，而攻毒組仔豬的器官組織結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯病變。肺臟：主要表現(xiàn)為間質(zhì)增生性肺炎，肺間質(zhì)的PAM細(xì)胞呈增生現(xiàn)象，導(dǎo)致問質(zhì)增寬，肺泡膈輕微變厚，有少量酸性粒細(xì)胞浸潤，大量巨噬細(xì)胞浸潤。腎臟：主要表現(xiàn)為急性出血性間質(zhì)性腎炎，皮質(zhì)部上皮細(xì)胞腫脹，有出血現(xiàn)象；髓質(zhì)部嚴(yán)重充血、淤血，有少量炎性細(xì)胞浸潤。脾臟：主要表現(xiàn)為急性壞死性脾炎，脾小體廣泛性充血、出血，淋巴組織灶狀壞死嚴(yán)重，且伴有中性粒細(xì)胞浸潤。肝臟：主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹、顆粒變性，伴有輕微充血、出血現(xiàn)象，有嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。心?。褐饕憩F(xiàn)為心肌纖維間有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤，且伴有輕微的充血、出血現(xiàn)象。

2.5炎性細(xì)胞因子水平檢測結(jié)果

2.5.1ROS水平由圖4可看出，與空白對照組仔豬相比，攻毒組仔豬在攻毒后第6 d的PAM細(xì)胞內(nèi)ROS水平極顯著升高（P<0.01，下同），表明PRRSv感染能提高仔豬PAM細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，且隨感染天數(shù)的增加而逐漸提高。

2.5.2NO含量由圖5所示，與空白對照組仔豬相比，攻毒組仔豬PAM細(xì)胞內(nèi)的NO含量較低，且隨感染天數(shù)的增加無顯著變化（P>0.05，下同），表明PRRSV感染能降低仔豬PAM細(xì)胞內(nèi)的NO含量。

2.5.3GSH含量由圖6可看出，與空白對照組仔豬相比，攻毒組仔豬在攻毒后第3 d的PAM細(xì)胞內(nèi)GSH含量極顯著降低，但至攻毒后第6 d略有回升，且顯著高于空白對照組（P<0.05，下同）。

2.5.4XOD、MPO和iNOS活性由圖7可看出，與空白對照組仔豬相比，攻毒組仔豬攻毒后第3 d的PAM細(xì)胞內(nèi)XOD活性極顯著降低，但至攻毒后第6 dPAM細(xì)胞內(nèi)的XOD活性顯著升高；仔豬PAM細(xì)胞內(nèi)的MPO和iNOS活性隨攻毒及感染天數(shù)的增加無顯著變化。

2.5.5

COX-1、COX-2、IL-6、IL-8、TL-10、IL-1β、IFN-y、MCP-1和TNF-a因子水平

由圖8可看出，PRRSV感染整體上能提高仔豬PAM細(xì)胞內(nèi)的COX-2、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-a因子水平，降低COX-1、IL-1β、IFN-y和MCP-1因子水平。與空白對照組仔豬相比，PRRSV感染早期（第3 d）攻毒組仔豬PAM細(xì)胞內(nèi)的COX-2、IL-6、IL-8和TNF-a水平極顯著升高，而COX-1水平極顯著降低。隨著感染天數(shù)的增加，PAM細(xì)胞內(nèi)COX-2、IL-6和IL-8因子水平呈下降趨勢，TNF-at因子水平呈上升趨勢，而IL-10、IL-1B、MCP-1、COX-1和IFN-y因子水平無顯著變化。

3討論

PRRS暴發(fā)于20世紀(jì)80年代末，PRRSV在不斷變異過程中形成了毒力更強(qiáng)的變異毒株，即高致病性PRRSV（田克恭，2015；宋吉衛(wèi)，2016）。高致病性PRRSV感染病豬除表現(xiàn)出經(jīng)典的藍(lán)耳病癥狀外，還可見體溫明顯升高（在41.0℃以上），且呈持續(xù)性高熱；皮膚發(fā)紅，部分病豬耳部發(fā)紺、出血、瘀血呈紫紅色；精神沉郁；食欲減退或廢絕；眼部結(jié)膜炎，眼瞼水腫；伴有咳嗽、氣喘等呼吸障礙。該病傳染性強(qiáng)，死亡率高，流行期長，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失（宋淑英等，2015；高延娜等，2016）。本研究以PRRSV-GXNN1396株人工感染斷奶仔豬，成功復(fù)制出典型的PRRS病癥，病豬出現(xiàn)持續(xù)高熱（40.0～42.0℃）、呼吸困難、食欲不振、精神沉郁、耳部發(fā)紺、眼部結(jié)膜炎等癥狀，與生產(chǎn)中的臨床發(fā)病特征相似。此外，剖解觀察發(fā)現(xiàn)病豬出現(xiàn)肺臟實變、淋巴結(jié)腫大等病變，組織結(jié)構(gòu)病理變化也主要表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎、淋巴樣組織炎癥，與Amarilla等（2017）、蘇景（2017）的研究結(jié)果一致。

病理組織學(xué)變化觀察及病毒分布檢測是研究PRRSV致病機(jī)理的基礎(chǔ)（王隆柏等，2016）。本研究結(jié)果顯示，PRRSV感染仔豬各主要器官的實質(zhì)細(xì)胞及有關(guān)淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度壞死和炎癥細(xì)胞浸入現(xiàn)象，尤其以肺臟、腎臟、脾臟等器官受損嚴(yán)重，出現(xiàn)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤；病毒核酸RT-PCR檢測結(jié)果顯示，PRRSV主要集中于肺臟、頜下淋巴結(jié)、血液和扁桃體等樣品組織中，與李冰等（2015）的研究結(jié)果相似，即PRRSV感染豬體后肺臟出現(xiàn)急性間質(zhì)性肺炎，大量肺泡細(xì)胞變性壞死、脫落，大量纖維和巨噬細(xì)胞增生，淋巴結(jié)壞死等現(xiàn)象。其原因是PRRSV在單核巨噬細(xì)胞內(nèi)完成病毒繁殖復(fù)制過程，主要侵害富含巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞的組織器官。PRRSV感染除引起廣泛性血管炎和炎性細(xì)胞聚集外，還隨滲出物進(jìn)入各組織部位并被巨噬細(xì)胞吞噬，同時病毒進(jìn)行自我復(fù)制，進(jìn)而造成特征性的壞死性炎癥病變（李易儒等，2016；陳澤芳和趙愛莉，2017）?？梢?，PRRSV主要侵害豬的免疫器官組織，以達(dá)到免疫抑制的效果。

PRRSV感染豬體會引起免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)作用（Correas et al，2017），刺激白細(xì)胞介素、淋巴因子、干擾素等細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)過程（宋爽，2013；李建臻等，2016）。本研究采用ELISA試劑盒檢測豬PAM細(xì)胞中ROS、NO和GSH含量，COX-1、COX-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、IFN-y、MCP-1和TNF-a因子水平及XOD、MPO和iNOS活性的變化，結(jié)果顯示，PRRSV感染早期（第3d）仔豬PAM細(xì)胞中的ROS水平及COX-2、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-a等因子水平均呈升高趨勢，且COX-2、IL-6、IL-8和TNF-a因子水平極顯著升高，因此推斷感染第3 d是病豬炎癥反應(yīng)的高峰期。本研究成功建立了PRRSV誘導(dǎo)仔豬體內(nèi)PAM細(xì)胞炎癥模型，可為PRRSV感染的臨床診斷及科學(xué)防控提供參考依據(jù)。但由于本研究僅選取攻毒后第3和6d兩個檢測時間點進(jìn)行對比分析，所得結(jié)論尚需通過多株P(guān)RRSV毒株進(jìn)行對比驗證，并增加檢測時間點，探究不同PRRSV毒株在不同時間點對仔豬免疫系統(tǒng)造成的危害，揭示PRRSV感染宿主的致病機(jī)制。

4結(jié)論

成功建立了PRRSV誘導(dǎo)仔豬體內(nèi)豬PAM細(xì)胞炎癥模型，進(jìn)一步佐證PRRSV主要侵害豬的免疫器官組織，以達(dá)到免疫抑制的效果，并推斷感染第3d是病豬炎癥反應(yīng)的高峰期。