土沉香幼苗炭疽病病原分離與鑒定

廖旺姣 鄒東霞 黃華艷 羅輯 趙程劼 吳耀軍

摘要：【目的】分離、鑒定土沉香幼苗炭疽病病原，為有效防治土沉香炭疽病提供病原學基礎(chǔ)?！痉椒ā繌耐脸料忝缙圆杉烤也颖荆捎贸Ｒ?guī)組織分離法分離病原菌，以傷口接種法接種病原菌進行致病性測定，并以形態(tài)學結(jié)合病原菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、β-微管蛋白（TUB2）和3-磷酸甘油醛脫氫酶（GPDH）分子系統(tǒng)學分析，對分離菌株進行鑒定?！窘Y(jié)果】分離獲得的AC01菌株在PDA培養(yǎng)基上25℃暗培養(yǎng)7d后，其菌落呈圓形，初為白色或灰白色，后期漸變成灰黑色，分生孢子無色，單細胞，圓柱狀，光滑，兩端鈍圓或一端稍尖，平均大小為（17.09±1.11）μmx（5.26±0.55）μm，分生孢子附著胞淺褐色，近橢圓形，邊緣光滑完整，平均大小為（6.72±0.77）μmx（5.45±0.68）μm；病原菌ITS、TUB2和GPDH 3個基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，AC01菌株與核果炭疽菌（Colletotrichum fructicola）模式菌株聚在同一進化分支上?！窘Y(jié)論】根據(jù)形態(tài)特征結(jié)合基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，確定AC01菌株為核果炭疽菌（C.fructicola），是國內(nèi)首次在土沉香上發(fā)現(xiàn)該菌引起炭疽病。

關(guān)鍵詞：土沉香；炭疽??；病原菌鑒定；核果炭疽菌

0引言

【研究意義】土沉香又名白木香，為國家二級瀕危保護植物，其產(chǎn)品沉香是一種傳統(tǒng)的名貴藥材和天然香料，經(jīng)濟價值非常高，其產(chǎn)品供不應求（陳樹思和唐為萍，2003；陳旭玉等，2017）。由于不合理采收，導致野生土沉香林遭受嚴重破壞，目前僅存少量零星植株（朱積余和廖培來，2006），產(chǎn)量遠不能滿足市場需求。近年來，廣西土沉香人工林發(fā)展迅速，種植面積逐漸擴大，隨之而來的土沉香病害也逐漸增多。2015～2016年本課題組對廣西林業(yè)科學研究院土沉香苗圃進行調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，土沉香苗部分葉片感染炭疽病，病斑壞死面積較大，引起落葉，影響植株正常生長，若使用帶病植株造林，勢必會影響植株后續(xù)健康生長。因此，明確土沉香幼苗炭疽病病原，了解該病發(fā)生流行規(guī)律，對制定精準防治措施具有重要意義。【前人研究進展】目前，關(guān)于土沉香苗木的研究主要集中在快繁培育（何旭君等，2006；黎明等，2006；徐強興等，2006）和生長節(jié)律（梁國校等，2011）方面，而針對苗木培育過程中可能出現(xiàn)有害生物危害的研究報道較少。李增平和陳堅（2008）研究發(fā)現(xiàn)了白木香幼苗的新病害——立枯病，經(jīng)鑒定其病原菌為立枯絲核菌張爭等（2013）首次明確白木香枝枯病病原菌為可可毛色二孢李濤等（2015）明確了云南河口土沉香炭疽病發(fā)生規(guī)律及環(huán)境影響因素，對科學防治土沉香炭疽病具有重要的指導作用，但未對其病原菌進行鑒定；蘇圣淞等（2017）首次發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲（Meloidogyne enterolobii Yang&Eisenback）可引起土沉香根結(jié)線蟲病。【本研究切入點】優(yōu)良無病苗木是營造健康人工林的關(guān)鍵因素之一，但目前有關(guān)土沉香苗期炭疽病病原的研究報道甚少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用組織分離法從感染炭疽病的土沉香葉片中分離病原菌菌株，采用病原菌形態(tài)學結(jié)合分子生物學的方法對分離獲得的病原菌菌株進行鑒定，為有效防治土沉香炭疽病提供病原學基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試樣品：2015～2016年從廣西林業(yè)科學研究院森林經(jīng)營研究所土沉香苗圃采集有褐色圓形或不規(guī)則形或輪紋狀病斑的葉片。培養(yǎng)基：分離、純化和鑒定培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000 mL），菌株保存斜面培養(yǎng)基（PCA培養(yǎng)基：馬鈴薯20g、胡蘿卜20g、瓊脂20g、水1000mL）。

1.2病原菌分離與培養(yǎng)

參考方中達（2001）的方法，采用常規(guī)組織分離法分離病原菌，分離獲得的病原菌菌株經(jīng)單孢純化后挑取菌絲保存至PCA斜面培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)10-15d，將斜面培養(yǎng)物置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＿x取AC01菌株為供試菌株。

1.3致病性測定

供試菌株在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)5d備用。采用傷口接種法接種病原菌，接種材料為健康的土沉香苗成熟葉。用解剖針在健康土沉香苗成熟葉近葉尖處刺6個針眼，用解剖刀挑取1.0 cmx0.5cm菌塊正面貼于傷口處，無菌脫脂棉沾1.0%葡萄糖水后覆蓋菌塊上，置于底部鋪有濕潤濾紙的30cmx15cm不銹鋼托盤中，保鮮膜覆蓋托盤，以接種無菌PDA為對照，處理及對照各接種10張葉片，常溫下（25～30℃）保濕72h，然后去除脫脂棉。每日定期觀察，記錄發(fā)病情況，發(fā)病后對發(fā)病部位進行二次分離，根據(jù)柯赫氏法則，確定分離株與接種菌株是否一致（方中達，2001）。

1.4病原菌鑒定

將AC01菌株置于PDA培養(yǎng)基在25℃恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)，逐日觀察。培養(yǎng)7d后，記錄菌株培養(yǎng)性狀，測量菌落直徑，若產(chǎn)生分生孢子器，則觀察、鏡檢、拍攝并測量病原分生孢子大??；若無，則繼續(xù)培養(yǎng)，直至產(chǎn)生子實體。參考楊友聯(lián)（2010）的方法進行分生孢子附著胞誘導，然后在顯微鏡下鏡檢、拍攝和測量其大小。

1.5病原菌分子系統(tǒng)學分析

1.5.1病原菌DNA提取病原菌的收集參考廖旺姣等（2015）的方法并略作修改。從25℃培養(yǎng)5d的菌落邊緣挑取菌絲接種到裝有100mL PDB（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、水1000 mL）培養(yǎng)液的三角瓶中，25℃、120 r/min暗培養(yǎng)，7 d后用4層滅菌紗布過濾，收集菌絲，置于80℃恒溫烘箱中烘干至恒重；放人滅菌研缽中，加入液氮充分研磨，參照天根生化（北京）科技有限公司植物基因組DNA提取試劑盒說明提供提取病原菌總DNA。

1.5.2基因序列測定及多基因系統(tǒng)分析參考朱英芝等（2015）的方法，選擇真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS，ITS4/ITS5）、β-微管蛋白（TUB2，T1/β-tu-bulin2b）和3-磷酸甘油醛脫氫酶（GPDH，GDF1/GDR1）基因的引物擴增，PCR擴增反應體系和程序、測序結(jié)果處理與系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建均參考朱英芝等（2015）的方法。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)病癥狀

主要危害土沉香幼苗葉片。從葉尖或葉緣開始發(fā)病，葉片感病初期出現(xiàn)褐色小病點，后擴展成圓形、三角形或不規(guī)則形褐色大斑，少數(shù)病斑可形成不明顯輪紋，后期病斑中部變?yōu)榛野咨?，可見輪狀小黑點，即病原菌分生孢子器（圖1-A）。病害發(fā)生嚴重時引起葉片發(fā)黃，提前脫落，造成樹勢衰弱。

2.2病原菌分離與致病性測定結(jié)果

從土沉香炭疽病樣品中共分離獲得20株菌株，各菌株菌落特征一致。依據(jù)柯赫氏法則，對分離株進行致病性測定，接種3 d后接種部位開始呈褐色，隨后病斑逐漸擴大呈圓形或不規(guī)則形，后期病斑上產(chǎn)生黑色分生孢子器，濕度較大時溢出橘紅色分生孢子堆，發(fā)病癥狀與自然感病癥狀相似（圖1-B）；對接種部位進行二次分離，結(jié)果顯示，二次分離菌株與接種菌株培養(yǎng)性狀一致，形態(tài)特征相同，因此可確定AC01菌株為土沉香炭疽病致病菌。

2.3病原菌菌落及形態(tài)特征

在PDA培養(yǎng)基上，AC01菌株的菌落平均生長速率為10.78 mm/d。菌落圓形，呈灰色至灰黑色，邊緣色稍淺，中間色深，氣生菌絲發(fā)達，絨毛狀，邊緣整齊，背面產(chǎn)生黑色色素（圖1-c和圖1-D）。培養(yǎng)后期產(chǎn)生黑色分生孢子器，其上可見橘紅色黏液，分生孢子無色，單細胞，圓柱狀，光滑，兩端鈍圓或一端稍尖，具有1～2個油球，平均大小為（17.09+1.11）μmx（5.26±0.55）岬（圖1-E）。分生孢子附著胞淺褐色，呈圓形或近橢圓形，邊緣完整，平均大小為（6.72±0.77）μmx（5.45±0.68）μm（圖1-F），形態(tài)特征與楊友聯(lián)等（2014）報道的核果炭疽菌（Colletotrichum fruc-ticola）相符。

2.4病原菌多基因序列分析結(jié)果

獲得AC01菌株的ITS、TUB2和GPDH基因序列后，用ClustalX 2.0對測得的序列及GenBank中下載的各基因序列分別進行比對，手工校正后各基因首尾相連，構(gòu)建上述3個基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果顯示，AC01菌株與包括C fructicola模式菌株C1315.3在內(nèi)的菌株聚在同一分支上，遺傳進化距離最近，與其他炭疽菌形成不同分支，具有較大的遺傳差異，各分支間均有99%或100%的支持率，遺傳關(guān)系清晰（圖2）。因此，確定AC01菌株為C fructicola。

3討論

C.fructicola可引起多種作物發(fā)生炭疽病，國外報道有小?？Х取⑸畈ㄈ~補血草、沙梨、草莓和葡萄等植物；國內(nèi)在棉花、茶樹和油茶等作物上亦有該菌的報道（李河等，2014；劉威等，2014；楊友聯(lián)等，2014）。本研究結(jié)果表明，土沉香幼苗炭疽病的病原菌為C.fructicola，土沉香是e fruc-ticola的新記錄寄主。

不同寄主植物獲得的C.fructicola培養(yǎng)性狀相似或略有差異。李河等（2014）、楊友聯(lián)等（2014）報道的C.fructicola菌落形態(tài)相似：菌落呈淺灰色至深灰色，邊緣色淺，背面微黃色，有黑色素沉積；本研究獲得的C.fructicola與其略有差異：菌落呈灰色至灰黑色，邊緣色稍淺，中間色深，背面亦有黑色素沉積，但沒有微黃色，可能與菌株來源不同有關(guān)。

本研究獲得的C.fructicola其分生孢子形態(tài)與楊友聯(lián)等（2014）報道的膠孢炭疽菌（C.gloeospori-oides）（CCOW3）非常相似。C.fructicola分子孢子呈圓柱狀，兩端鈍圓或一端稍尖，C.gloeosporioides分生孢子也呈圓柱狀，兩端鈍圓，部分孢子基部寬于頂部，從形態(tài)上很難將兩者區(qū)分。楊友聯(lián)等（2011）報道使用多基因分子系統(tǒng)學分析法能有效解決形態(tài)分類未解決的疑問，提高炭疽菌的識別準確率。因此，本研究采用ITS、TUB2和GPDH 3個基因聯(lián)合分析，結(jié)果表明，土沉香炭疽病菌AC01菌株與不同來源的C.fructicola聚在同一分支上，而與C.gloeospo-rioides（CCOW3）形成明顯的進化分支，有效地區(qū)分了這兩種炭疽菌，說明使用多基因分子系統(tǒng)學分析法鑒別炭疽病菌種類具有可行性。

4結(jié)論

通過對病原菌的形態(tài)特征進行觀察并結(jié)合多基因分子系統(tǒng)分析，確定土沉香幼苗炭疽病病原菌為核果炭疽菌（C.fructicola），是國內(nèi)首次在土沉香上發(fā)現(xiàn)該菌引起的炭疽病。增補了C.fructicola的寄主范圍，在防治其他由C.fructicola引起炭疽病的寄主植物時，要充分了解C.fructicola的寄主范圍，統(tǒng)籌防治，才能取得良好的防治效果。