不同pH、溫度、金屬離子 對溶菌酶抗菌穩(wěn)定性的初步研究

郭文燕,周勝男,余雅琦,伍金娥,2,常 超,2,*

(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023;2.武漢輕工大學教育部大宗糧油精深加工省部共建重點實驗室,湖北武漢 430023)

溶菌酶(Lysozyme,LYS),又稱胞壁質酶或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶,是一種能水解肽聚糖的堿性酶,作用靶點是連接N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺間的β-1,4糖苷鍵[1-3]。肽聚糖存在于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞壁中,溶菌酶對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有殺滅效果[4-6]。另有報道,溶菌酶能與許多外源和內源性物質結合,從而發(fā)揮其抗菌消炎、抗病毒等作用[7-9],因此溶菌酶被廣泛應用于多個行業(yè),如食品[10-11]、醫(yī)藥[12]等,特別用于食品防腐保鮮。目前有大量的文獻報道溶菌酶用于水產品[13-14]、肉類[15-16]、果蔬[17-18]、乳品[19]儲藏和保鮮,絕大多數是復合配方并且配方種類繁多,如何高效合理的運用溶菌酶是很多學者研究的熱點。目前有關于溶菌酶對有機溶劑、pH和溫度穩(wěn)定性的研究報道[20-25],其評價指標大多采用酶的活性指標,較少采用對活菌的抑制率來評價,乙醇對溶菌酶活性無顯著影響[26],但溫度和pH對溶菌酶的活性有較大影響[27]。不同食品的加工條件和貯藏環(huán)境是不一樣的,因此了解溶菌酶在不同的加工條件與環(huán)境下是否保持抗菌活性對指導溶菌酶的使用顯得非常有意義。本文以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157∶H7為受試菌,采用溶菌酶的活菌抑制率為評價指標,系統評價不同溫度、pH與金屬離子對溶菌酶抗菌活性的影響,旨在闡明溶菌酶在不同條件下對病原菌抗菌活性的影響,從而為在不同食品中溶菌酶的合理利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

溶菌酶標準品(20萬 U/g)、胰蛋白胨、酵母粉、硫酸鋅、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、硫酸錳 南京建成生物科技有限公司;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、大腸桿菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7,E.coliO157∶H7) 武漢輕工大學教育部大宗糧油精深加工省部共建重點實驗室保藏;LysogenyBroth(LB)液體培養(yǎng)基 胰蛋白胨10 g,酵母粉5 g,NaCl 10 g,蒸餾水,1000 mL,按常規(guī)制備培養(yǎng)基的方法制備,121 ℃滅菌15 min,備用;LB固體培養(yǎng)基 在液體培養(yǎng)基的基礎上加入2%左右的瓊脂。

Enspire酶標儀 美國Enspire公司;Milli-Q超純水器 美國Millipore公司;SW-CJ-2FD雙人超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;GHP-9050隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學儀器有限公司;YXQ-LS-70A自動高壓滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶菌酶最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)的測定 精確稱取適量的溶菌酶干粉,溶于無菌水中。采用微量稀釋法測定溶菌酶MIC[28],取兩個無菌的96微孔板置于超凈臺上,將溶菌酶溶液用無菌水倍比稀釋,分別將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157∶H7兩種菌懸液調制相同濃度(106～107CFU/mL),加入對應的96微孔板中,使溶菌酶終濃度為0.17、0.33、0.65、1.3、2.6、5.2、11、21 mg/mL,混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,于酶標儀600 nm測定其光密度值(OD值)[29]。利用肉眼觀察溶液的渾濁變化與OD值相結合的方法,判定MIC值。

1.2.2 不同pH對溶菌酶抗菌活性的影響 考察溶菌酶在pH4～9范圍內的抗菌活性變化,根據1.2.1確定的溶菌酶MIC設計4個溶菌酶的作用濃度(0.65、1.3、2.6、5.2 mg/mL)。將4個不同濃度溶菌酶的pH分別調至4～9,作用一段時間后,取兩個無菌的96微孔板置于超凈臺上,將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157∶H7兩種菌懸液(106～107CFU/mL)分別與上述處理后的溶菌酶等體積加入對應的96微孔板中,使溶菌酶的終濃度分別為0.33、0.65、1.3、2.6 mg/mL,混勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察溶液的渾濁情況,于酶標儀600 nm測定OD值[29],比較不同pH下溶菌酶的抑菌穩(wěn)定性。

1.2.3 不同溫度對溶菌酶抗菌活性的影響 考察溶菌酶在4～121 ℃溫度范圍內的抗菌活性變化。將4個不同濃度的溶菌酶分別置于4、20、40、60、80、100、121 ℃條件下處理30 min,冷卻后,按照1.2.2步驟加樣、測OD值[29],比較不同溫度處理對溶菌酶抗菌活性的影響。

1.2.4 不同金屬離子對溶菌酶抗菌活性的影響 選擇食品基質中具有代表性的6種金屬離子考察對溶菌酶抗菌活性的影響,設計3個溶菌酶濃度,5個金屬離子濃度。分別配制0.1 mol/L KCl、NaCl、ZnSO4、MnSO4、CaCl2、MgCl2母液并高溫滅菌,倍比稀釋至工作濃度。將系列濃度的金屬離子、不同濃度的溶菌酶以及菌液分別加入對應的96微孔板中,使金屬離子終濃度分別為0.15、1.25、2.5、5、10 mmol/L,溶菌酶終濃度分別為0.33、0.65、1.3 mg/mL。混勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察微孔中溶液的渾濁度,測定OD值,計算抑制率[30],溶菌酶對照中金屬離子濃度為0。

抑制率(%)=[(溶菌酶對照吸光值-金屬離子溶菌酶聯用吸光值)/溶菌酶對照吸光值]×100

式(1)

1.2.5 Zn2+對溶菌酶協同抗菌的驗證 根據1.2.4的結果篩選出協同效果最強的Zn2+,將比較對象變?yōu)榭瞻讓φ战M,驗證Zn2+對溶菌酶協同抗菌效果。設計4個Zn2+濃度0.15、0.6、2.5、10 mmol/L,3個溶菌酶濃度0.33、0.65、1.3 mg/mL。具體操作同1.2.4所示。抑制率計算[30]公式如下,空白對照中Zn2+、溶菌酶濃度均為0。

抑制率(%)=[(空白對照吸光值-Zn2+溶菌酶聯用吸光值)/空白對照吸光值]×100

1.2.6 數據統計分析 實驗均重復3次,用平均值±標準偏差表示。采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對實驗數據進行方差分析和顯著性測驗(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 溶菌酶最小抑菌濃度

不同濃度的溶菌酶對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157∶H7抑制趨勢見圖1,溶菌酶對金黃色葡萄球菌的抑制隨著濃度的增加而增強,當濃度超過1.3×10-3g/mL,OD值趨于平緩,并且培養(yǎng)液澄清透明,由此判斷溶菌酶對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為1.3×10-3g/mL,同樣的方法判斷溶菌酶對大腸桿菌O157∶H7最小抑菌濃度為2.6×10-3g/mL。由圖1變化趨勢可知,相同濃度的溶菌酶對金黃色葡萄球菌的抑制效果強于大腸桿菌O157∶H7,這與溶菌酶水解肽聚糖的抑菌機制有關,金黃色葡萄球菌細胞壁中肽聚糖的含量比大腸桿菌O157∶H7細胞壁中含量高[31]。

圖1 不同濃度溶菌酶對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157∶H7生長的影響Fig.1 Effect of different concentrations of LYS against S. aureus and E. coli O157∶H7

2.2 不同pH對溶菌酶抗菌活性的影響

4個不同濃度的溶菌酶經過不同pH處理后對兩種細菌的抑制結果見圖2,由圖2A可知,溶菌酶在高濃度(超過MIC)時,pH變化對溶菌酶抑制大腸桿菌O157∶H7的影響較小,濃度越高,影響越小。但溶菌酶在低濃度(小于MIC)時,pH變化對溶菌酶抑制大腸桿菌O157∶H7的影響較大,隨著pH升高,OD值升高,抑制效果減弱。當pH小于7即酸性條件,溶菌酶對大腸桿菌O157∶H7抑制效果要強于堿性條件,說明溶菌酶在酸性條件穩(wěn)定性較好,抑菌效果較堿性條件下顯著,這可能是在堿性條件下,溶菌酶結構易被破壞,酶活性降低使得溶菌酶抗菌效果降低,這與劉慧研究結果基本一致[32]。對比圖2A和圖2B可知,金黃色葡萄球菌與大腸桿菌O157∶H7具有類似的變化趨勢。綜合圖2可以看出,溶菌酶在pH4～6具有更好的穩(wěn)定性,對金黃色葡萄球菌與大腸桿菌O157∶H7均具有較好的抑菌效果。這些結果表明,溶菌酶優(yōu)先用于酸性食品的儲藏保鮮,用作堿性的食品保藏時,需提高溶菌酶的濃度。

圖2 不同pH對溶菌酶抑菌活性的影響Fig.2 Effect of pH values on antibacterial activity of LYS注：A：大腸桿菌O157∶H7;B：金黃色葡萄球菌。

2.3 不同溫度對溶菌酶抗菌活性的影響

4個不同濃度的溶菌酶經過不同溫度處理后對兩種細菌的抑制結果見圖3,由圖3可知,溶菌酶在高濃度(超過MIC)和低濃度(小于MIC)時,溫度升高,OD值波動范圍較小,說明溫度變化對溶菌酶抑制大腸桿菌O157∶H7和金黃色葡萄球菌的影響甚微,抗菌活性不受影響。該結果與Cosentino等[33]報道一致,濃縮和殺菌處理不影響溶菌酶的濃度或抗菌活性。溫度實驗結果綜合表明,溶菌酶具有較強的熱穩(wěn)定性,在食品加工的溫度范圍內,其抗菌活性幾乎不受影響,適合用于冷熱食品的保藏保鮮。

圖3 不同溫度對溶菌酶抑菌活性的影響Fig.3 Effect of thermal treatments on antibacterial activity of LYS注：A：大腸桿菌O157∶H7;B：金黃色葡萄球菌。

2.4 不同金屬離子對溶菌酶抗菌活性的影響

3個不同濃度的溶菌酶經過不同金屬離子作用后對兩種細菌的抑制結果見圖4和圖5,由圖4可知,Zn2+與Mn2+可以增強溶菌酶對金黃色葡萄球菌的抑制作用,具有協同抑菌效應,其中以Zn2+最為顯著,并且Zn2+在低濃度(0.15 mmol/L)可以表現出很強的抑制作用,而Mn2+則需要在較高濃度(2.5 mmol/L)才能表現出較強的抑制作用。Zn2+表現出較強的協同抑菌效應,其原因可能與Zn2+本身具有一定的抗菌能力有關。有文獻報道,大多數細菌細胞膜帶負電荷,Zn2+的正電荷在靜電作用下與細菌的細胞膜接觸,從而使細菌生長受阻或死亡[34],具有與溶菌酶不同的抗菌途徑,從而起到協同抑菌效應。相反,Mg2+與K+可以抵消溶菌酶對金黃色葡萄球菌的抑制效果,具有拮抗抑菌效應,其中以Mg2+最為顯著,可以促進金黃色葡萄球菌的生長,其原因可能是細菌在生長過程中需要Mg2+的參與,特別是激活細菌的有些酶系。而Na+與Ca2+僅表現出較弱的協同抑菌效應,對溶菌酶抑制金黃色葡萄球菌的效果影響較小。

圖4 不同金屬離子對溶菌酶抑制金黃色葡萄球菌效果的影響Fig.4 Effect of metal ions on antibacterial activity of LYS against S. aureus注：A：溶菌酶濃度0.33 mg/L;B:溶菌酶濃度0.65 mg/L;C:溶菌酶濃度1.3 mg/L。

對比圖4和圖5,不同金屬離子對溶菌酶抑制大腸桿菌O157∶H7的效果與金黃色葡萄球菌類似,Zn2+與Mn2+同樣可以增強溶菌酶對大腸桿菌O157∶H7的抑制作用,Mn2+在溶菌酶高濃度時展現出更強的抑制作用(圖5C)。Mg2+同樣

圖5 不同金屬離子對溶菌酶抑制大腸桿菌O157∶H7效果的影響Fig.5 Effect of metal ions on antibacterial activity of LYS against E. coli O157∶H7注：A：溶菌酶濃度0.33 mg/L； B：溶菌酶濃度0.65 mg/L;C：溶菌酶濃度1.3 mg/L。

可以抵消溶菌酶對大腸桿菌O157∶H7的抑制效果,但Ca2+則呈現與Mg2+類似的拮抗抑菌效應,可能原因是大腸桿菌O157∶H7生長過程中,需要Ca2+參與下合成蛋白酶[34]。綜合圖4、圖5結果表明,溶菌酶用于食品儲藏保鮮時,應避免在基質中含有較多Ca2+、Mg2+的食品中使用,優(yōu)先考慮富含Zn2+、Mn2+的食品中使用,必要時可以通過添加Zn2+提高溶菌酶的抗菌效果。

2.5 Zn2+對溶菌酶協同抗菌的驗證

Zn2+對溶菌酶協同抗菌的驗證結果見圖6,圖6結果表明,Zn2+與溶菌酶聯合使用的抑菌效果要強于單一的Zn2+,具有協同抗菌效應,但Zn2+在高濃度(10 mmol/L)時,與溶菌酶無協同抗菌效應,其原因是過高的Zn2+完全抑制了細菌生長[35]。而圖4、圖5結果顯示,Zn2+與溶菌酶聯合使用的抑菌效果要強于單一的溶菌酶,綜合圖4、圖5、圖6結果表明,Zn2+對溶菌酶具有協同抗菌效應。

圖6 Zn2+對溶菌酶協同抗菌的驗證Fig.6 Validation of synergistic antibacterial activity of Zn2+ and LYS注：A:大腸桿菌O157∶H7；B:金黃色葡萄球菌。

3 結論

本研究以金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽性菌和以大腸桿菌O157∶H7為代表的革蘭氏陰性菌為受試菌,系統研究了溫度、pH、金屬離子對溶菌酶抗菌活性的影響。結果顯示,溶菌酶在pH4～6具有更好的穩(wěn)定性,適用于酸性食品的儲藏保鮮,在堿性環(huán)境下,需提高溶菌酶的劑量。在4～121 ℃下,溶菌酶具有良好的熱穩(wěn)定性。溶菌酶與Mn2+、Zn2+具有一定的協同抗菌效應,而與Ca2+、Mg2+具有一定的拮抗抗菌效應,抗菌效果會受到一定程度的減弱,協同或拮抗抗菌效應的原因和機制有待進一步深入研究和分析。

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