敦煌鹽堿土中抗黃芪根腐病放線菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

牛世全，趙 丹，豆建濤，豆雅楠，朱學(xué)泰

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

黃芪為多年生豆科植物，以根入藥，是藥用價值很高的中藥材.近些年，隨著黃芪種植面積的增大，以黃芪根腐病為主的病害問題也日趨嚴(yán)重，制約著黃芪的產(chǎn)量和品質(zhì).黃芪根腐病是由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)引起黃芪根部的腐爛病變[1].該病的防治方法以化學(xué)防治為主再結(jié)合一些農(nóng)業(yè)管理措施，但是農(nóng)藥的長期使用致使病原菌產(chǎn)生耐藥性且對生態(tài)環(huán)境有極大破壞.生物農(nóng)藥因其具有無污染、成本低、不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，漸漸受到研究者的重視.目前對黃芪根腐病的生物防治也有了一些研究，如滕艷萍等[2]用木霉制劑抑制黃芪根腐病，發(fā)現(xiàn)木霉對病原菌菌絲有消解作用；趙慶芳等[3]采用苦參堿、槐啶堿、槐果堿、對羥基苯甲酸和阿魏酸5種物質(zhì)對黃芪根腐病進行抑菌性研究，發(fā)現(xiàn)槐啶堿和苦參堿混合液對黃芪根腐病具有明顯抑制作用.

放線菌廣泛存在于自然界中，可產(chǎn)生大量豐富的抗生素.據(jù)統(tǒng)計，應(yīng)用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)方面的抗生素有70% 產(chǎn)于放線菌[4].近些年，不少研究者又把目光轉(zhuǎn)向了極端環(huán)境放線菌的研究[5-8].在高溫、高鹽、高堿等極端環(huán)境中生長的放線菌，擁有獨特的生理機制和特殊的基因類型，從而可以產(chǎn)生特殊的活性物質(zhì)[9].本課題組長期開展河西走廊鹽堿土中生防放線菌資源的研究，目前已有一些成果.從石羊河、黑河及疏勒河3大流域鹽堿土中分別篩選出對牛無乳鏈球菌和豬金黃色葡萄球菌、馬鈴薯干腐病菌、黃芪根腐病菌有生防作用的菌株[10-12]，在張掖和酒泉地區(qū)分離篩選到對油菜菌核病、立枯絲核菌抑菌效果顯著的菌株[13-14].

本研究從敦煌地區(qū)的鹽堿土中分離篩選出對黃芪根腐病具有生防作用的菌株，并對生防菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，為黃芪根腐病的生物防治提供理論和實踐應(yīng)用支撐.

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來源：2015年10月從甘肅敦煌地區(qū)共采集土樣5份(表1).每個樣點采用5點取樣法，樣品采集后于4 ℃低溫保存并盡快進行放線菌的分離.

表1 土樣基本信息

供試病原菌：黃芪根腐病尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、黃芪根腐病茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)、馬鈴薯茄鏈格孢菌(Alternariasolani)、油菜立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、蘋果樹腐爛病菌(V.mali)為本研究室保藏，黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所惠贈.

培養(yǎng)基：A高氏Ⅰ號培養(yǎng)基、B改良脯氨酸培養(yǎng)基[15]、C幾丁質(zhì)培養(yǎng)基[16]、D海藻糖- 脯氨酸培養(yǎng)基[17]、E甘油-門冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基[18]、PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、小米浸液培養(yǎng)基、發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(大豆粉 20 g·L-1,玉米粉 30 g·L-1,NaCl 1 g·L-1,K2HPO41 g·L-1,CaCO33 g·L-1，pH自然).

1.2 拮抗放線菌的分離與篩選

采用稀釋涂布法和劃線法分離純化放線菌.將分離到的放線菌與尖孢鐮刀菌采用平板對峙法接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)4～7 d后，測量菌落直徑，計算抑菌帶.

將抑菌帶大于30.0 mm的8株放線菌用菌絲生長速率法進行復(fù)篩，計算抑菌率[19].

將生防效果顯著的放線菌株進行抑菌廣譜性測定.以5種病原菌為靶標(biāo)菌，按初篩、復(fù)篩方法測定，用公式(1)和(2)計算抑菌帶大小及抑菌率.

1.3 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：采用插片法，28 ℃培養(yǎng)7～14 d后，觀察氣生菌絲、基內(nèi)菌絲的生長狀況和可溶性色素的產(chǎn)生等形態(tài)特征，并在光學(xué)顯微鏡下觀察氣生和基內(nèi)菌絲的形狀、孢子鏈的有無及其形狀.

培養(yǎng)特征及生理生化特征：根據(jù)《鏈霉菌鑒定手冊》及文獻[20]提供的方法將待鑒定菌株A12-2-11劃線接種于ISP1～ISP5、PDA、察氏培養(yǎng)基等8種培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7～14 d后記錄氣生菌絲和基內(nèi)菌絲的顏色以及可溶性色素的產(chǎn)生.生理生化實驗包括明膠液化、牛奶凝固與胨化、黑色素產(chǎn)生等.

分子學(xué)鑒定：采用微波法[21]提取DNA，利用放線菌特異性引物S20/A19對菌株16S rDNA基因進行PCR擴增[22].PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京奧科生物科技有限公司測序.測序結(jié)果用BLAST程序?qū)λ眯蛄信cGenBank中已知序列進行比對分析，用MEGA 7.0 軟件以鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

不同碳、氮源對發(fā)酵濾液抑菌作用的影響：在其他培養(yǎng)條件不變的情況下，分別用麥芽糖、淀粉、蔗糖和葡萄糖等量替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的玉米粉；用牛肉膏、酵母粉、KNO3和(NH4)2SO4等量替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的黃豆粉，其他成分不變.按菌絲生長速率法測定，每組設(shè)置3個重復(fù)，確定培養(yǎng)基最佳碳源和氮源.

正交試驗：采用最佳碳源(蔗糖)、最佳氮源((NH4)2SO4)、NaCl和pH共4個因素，設(shè)置3個水平，按L9(43)正交表進行正交實驗(表2)，以菌絲生長速率法測定，每組重復(fù)3次.

正交實驗結(jié)果論證：用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基按菌絲生長速率法測定抑菌率.

表2 發(fā)酵條件正交試驗設(shè)計

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

利用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌的分離和對黃芪根腐病具有拮抗作用放線菌的篩選

采用不同培養(yǎng)基從5個土壤樣品中共分離得到321株放線菌，其中高氏Ⅰ號培養(yǎng)基分離得到的菌株數(shù)最多，共146株.

采用平板對峙法篩選出18株對尖孢鐮刀菌有抑菌效果的放線菌，占放線菌總數(shù)的5.6%.將抑菌帶大于30 mm的放線菌菌株進行菌絲生長速率法測定后，結(jié)果顯示供試菌株的發(fā)酵濾液抑菌率為10.49%～41.77%,其中菌株A12-2-11抑菌效果最強，初篩抑菌帶為32.50 mm，發(fā)酵濾液抑菌率為41.77%.

菌株A12-2-11的廣譜性結(jié)果顯示，菌株A12-2-11對供試的5種植物病原菌均有一定的抑制作用，其中對黃芪根腐病茄腐鐮刀菌抑菌效果最強，抑菌帶大小為31.00 mm，發(fā)酵濾液抑菌率達到63.41%(表3).

表3 A12-2-11對5種病原真菌的抑制作用

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 菌株A12-2-11的鑒定

采用培養(yǎng)形態(tài)與生理生化特征對菌株A12-2-11初步鑒定結(jié)果顯示，菌株A12-2-11在高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上，氣生菌絲粉狀、前期白色后期黃色，基內(nèi)菌絲呈黃色，不產(chǎn)生可溶性色素(圖1).在其他7種培養(yǎng)基上生長狀態(tài)不同，氣絲與基絲顏色相同或不同，均無可溶性色素產(chǎn)生(表4).

表4 菌株A12-2-11在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

圖1 菌株A12-2-11在高氏1號培養(yǎng)基上的培養(yǎng)形態(tài) 及顯微形態(tài)

菌株A12-2-11不能使纖維素水解，不產(chǎn)生H2S和黑色素，不能使硝酸鹽還原；能使明膠液化、牛奶凝固與胨化、淀粉水解；不能利用果糖和肌醇，能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖和甘露醇.

對菌株A12-2-11的16S rDNA序列進行PCR擴增和測序，用MEGA 7以鄰接法構(gòu)建菌株A12-2-11的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2).16S rDNA分子學(xué)鑒定結(jié)果顯示，菌株A12-2-11與黃色長孢鏈霉菌(Streptomyceslongisporoflavus)相似性達到99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果及生理生化反應(yīng)，參考文獻[23]及《鏈霉菌鑒定手冊》將菌株A12-2-11初步鑒定為黃色長孢鏈霉菌(Streptomyceslongisporoflavus).

2.3 菌株A12-2-11發(fā)酵條件的優(yōu)化

對菌株A12-2-11發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果顯示，當(dāng)碳源為蔗糖時菌株A12-2-11的發(fā)酵濾液抑菌活性最強，抑菌率達到50.58%；當(dāng)(NH4)2SO4為氮源時菌株A12-2-11的發(fā)酵濾液抑菌活性最強，抑菌率可達57.53%(圖3).

圖2 鄰接法構(gòu)建菌株A12-2-11的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 不同(a)碳、氮源(b)對菌株A12-2-11 抑菌作用的影響

正交試驗結(jié)果顯示(表5的K值和極差值R)，4因素對菌株A12-2-11的發(fā)酵濾液抑菌活性影響順序為A>D>B>C，最佳水平組合為A2B1C2D3，其中A因素(NH4)2SO4對菌株A12-2-11抑菌率影響顯著.因此，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：蔗糖10 g·L-1，(NH4)2SO410 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，CaCO31 g·L-1，pH 8(表5).正交試驗結(jié)果表明，菌株A12-2-11經(jīng)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后，其發(fā)酵濾液的抑菌率為42.63%；經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后發(fā)酵濾液抑菌率達75.02%(圖4，圖5).

3 討論

目前對黃芪根腐病的防治主要以化學(xué)農(nóng)藥和栽培管理相結(jié)合的方法，如將多菌靈粉劑整地噴灑于地表，及時耙地合理灌溉后，防效可達47%～56%[1].但化學(xué)農(nóng)藥的使用導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性，而且使自然環(huán)境遭到破壞.因此，生物防治的開發(fā)和利用成為了一大研究熱點，趙慶芳等[24]研究發(fā)現(xiàn)洋蔥、小麥、苦豆子等9種植物的水提物對黃芪根腐病菌有抑制作用，可與黃芪輪作來防治該??；馬偉[25]等利用蛇床子、知母等中藥的提取液制備含藥培養(yǎng)基，接種黃芪根腐病菌后發(fā)現(xiàn)蛇床子的提取物抑菌率可達到96.13%.利用植物或中藥材的提取物對黃芪根腐病進行生物防治，成本較高，在實際應(yīng)用中有一定的限制.而放線菌作為能夠產(chǎn)生大量抗生素的重要微生物資源，由于其無毒、高效、對環(huán)境影響小等特點而被廣泛開發(fā)與應(yīng)用.因此，利用放線菌代謝產(chǎn)物對黃芪根腐病害進行生物防治是一條較為理想的途徑.

表5 正交實驗結(jié)果

圖4 優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基對菌株A12-2-11 抑菌作用的影響

a.對照；b.優(yōu)化前；c.優(yōu)化后

本研究從敦煌地區(qū)鹽堿土中分離篩選出一株對黃芪根腐病菌具有生防作用的放線菌株A12-2-11，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化及16S rDNA序列分析，初步鑒定為黃色長孢鏈霉菌(Streptomyceslongisporoflavus).黃色長孢鏈霉菌在生物防治上的應(yīng)用已有一些報道，韓立榮等[26]對黃色長孢鏈霉菌的拮抗作用進行了研究，以15種植物病原菌為靶標(biāo)菌，發(fā)現(xiàn)菌株對所有病原菌均有一定的抑制作用，其中對油菜核病菌抑制作用最明顯；劉占良等[27]對黃色長孢鏈霉菌的抗生素耐藥基因進行研究，發(fā)現(xiàn)其可以產(chǎn)生耐藥基因tnrB23進行替曲那新(Tetronasin)外排作用.

發(fā)酵培養(yǎng)是抗生素是否可以進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)，若是缺乏合理的發(fā)酵工業(yè)，也就不能將抗生素產(chǎn)生菌的優(yōu)勢充分發(fā)揮出來.抗生素產(chǎn)生菌發(fā)酵除受營養(yǎng)因素的限制以外,適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件也是不可忽視的重要因素[28].本研究采用單因素實驗和正交試驗相結(jié)合的方法對生防菌株A12-2-11進行發(fā)酵條件優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基.但未考慮實際應(yīng)用中成本等因素，所以應(yīng)在此基礎(chǔ)上考慮成本及作用的研究，以便推廣應(yīng)用.

4 結(jié)束語

本研究從敦煌鹽堿土中篩選得到一株對黃芪根腐病具有生防作用的放線菌A12-2-11，經(jīng)培養(yǎng)條件優(yōu)化后抑菌率達到75.02%.后續(xù)我們計劃將此菌株與牛世全等[12]篩選出的黃芪根腐病生防菌制成聯(lián)合菌劑，對其研制方法和田間黃芪根腐病生物防治作用進行進一步探索.

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