初探腸道菌群對導盲犬篩選及培訓的影響

許 堯 張利龍 胡雨奇 龍尚琴

孫露丹 王靖宇 李 明 董建一

導盲犬是輔助視障人士出行的工作犬。目前，我國的導盲犬培訓成功率低、成本高、周期長，因此，如何更有效地輔助導盲犬篩選及培訓是科研工作者一直在探索的問題。導盲犬培訓成功與否主要是通過動物行為學對犬的興奮性、焦慮、應激反應和認知功能等行為和情緒進行評判。近年來的研究顯示，腸道菌群是人體重要的“微生態(tài)器官”，可通過神經遞質途徑影響哺乳動物的行為和情緒，但目前這方面的研究較少。導盲犬腸道菌群的分析研究及干預手段可能有助于輔助導盲犬的篩選和培訓。

導盲犬是一種為視障人士提供幫助的工作犬。目前主要通過動物行為學測試對犬的神經類型（如應激反應、焦慮、抑郁和認知功能等行為和情緒）進行評判達到篩選的目的，但其具有較強的主觀性。腸道菌群參與了人類及哺乳動物體內多種生理過程，越來越多的研究證明，人體內存在的腦-腸軸（brain-gut axis）可能是大腦與胃腸道之間的關鍵調控通路，大腦可能通過免疫系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)等多種途徑調控胃腸功能，而腸道菌群則可能通過迷走神經、神經遞質（如5-羥色胺、多巴胺）、神經營養(yǎng)因子（如腦源性神經營養(yǎng)因子）等途徑影響大腦功能。有研究表明，腸道菌群可能影響人類及哺乳動物的大腦發(fā)育，腸道菌群失調可產生情感障礙、自閉癥譜系障礙等疾病。因此對于導盲犬腸道菌群的研究及干預可能有助于提高導盲犬培訓成功率。

一、導盲犬的應用情況和研究進展

目前，導盲犬培訓成功率低（30%～40%）、培訓成本高（約15萬元/頭）、培訓周期長（約18個月）等問題導致每年培訓合格的導盲犬數(shù)量稀少，難以滿足我國1691萬視障人士的需求。導盲犬的篩選與培訓可能受到多種因素的影響，其中，犬的神經類型是影響導盲犬篩選的關鍵因素。同一犬種一般分為4種神經類型，即興奮型、活潑型、安靜型、弱型。合格的工作犬必須具備平和的心態(tài)、穩(wěn)定的性情以及抗外界干擾能力，同時也不具有攻擊性，因此安靜型犬是導盲犬篩選和培訓工作中的重要考察指標。Harvey N D等的數(shù)據(jù)調查和其他研究成果表明犬神經類型篩選工作中的重要參考指標應包括犬注意力分散性（distractibility）、興奮性（excitability）、一般焦慮（general anxiety）、敏感性（sensitivity）等方面特征。

動物行為學測試是指在標準的實驗條件下，利用特定刺激來引起動物的行為反應，通過對行為反應進行統(tǒng)計、分析、對比，評估動物的主要行為類型或特征。犬的動物行為學測試是導盲犬行為學研究中的重要工具，有利于神經類型的早期分析和篩選。廣泛的實踐證明，由于缺乏統(tǒng)一的測試標準和方法，動物行為學測試仍存在一定的主觀性、局限性和未知性，其不僅受到犬的品種、性別、年齡、生理狀況等諸多內在因素的作用，還會受到犬所處的生活環(huán)境、訓練人員的經驗、培訓方法等外在因素的影響。因此，尋找客觀有效的導盲犬篩選方法是世界各國導盲犬機構一直在探索的問題。

二、腸道菌群對哺乳動物行為和情緒的影響

腸道菌群與哺乳動物的中樞神經系統(tǒng)功能密切相關，可直接調控其行為和情緒。腦源性神經營養(yǎng)因子（Brain-Derived Neurotropic Factor，BDNF）是一種能刺激神經發(fā)生、調節(jié)突觸形成的可塑性蛋白質，還可參與機體認知、行為和情緒等多方面的活動，在一項研究中發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，無菌小鼠大腦皮層和海馬中BDNF表達量明顯降低；而Bercik P等在研究中給腸道慢性炎癥小鼠喂食雙歧桿菌后，其BDNF的mRNA水平可恢復正常。利用TNBS（2,4,6-三硝基苯磺酸）誘導的結腸炎小鼠腸道菌群組的實驗發(fā)現(xiàn)小鼠大腸桿菌（Escherichia coli，EC）豐度增加和約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii，LJ）豐度減少，并伴有明顯的記憶障礙。同時，研究還發(fā)現(xiàn)EC可損害小鼠的學習能力并導致記憶障礙，而LJ可減輕TNBS或EC處理小鼠的結腸炎和記憶障礙癥狀，表明腸道菌群可對哺乳動物的學習和記憶能力產生重要影響。Stilling等發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，無菌小鼠許多重要腦生理過程如神經傳遞、神經元可塑性、代謝和形態(tài)發(fā)育的基因表達具有顯著差異，而這些基因的表達與認知、情緒和社會行為密切相關。

另外，腸道菌群與哺乳動物精神、神經系統(tǒng)功能障礙關系密切，Kelly等的研究結果表明抑郁癥小鼠腸道菌群在組成或多樣性方面發(fā)生了明顯變化；研究顯示小鼠在幼年時期受到母子分離刺激，成年后其表現(xiàn)出的過度應激行為可能與其腸道菌群的長期改變有關；Crumeyrolle-Arias等研究發(fā)現(xiàn)在開放區(qū)域測試中，無菌大鼠相比于SPF（Specific pathogen Free）大鼠具有更多焦慮行為，包括潛伏時間延長、在中央區(qū)域活動的次數(shù)減少及在周邊區(qū)域活動的時間增加等。研究表明服用益生菌可明顯改善小鼠由慢性應激刺激引起的焦慮行為，具有積極而明確的治療作用。

三、腸道菌群調節(jié)宿主行為和情緒的作用途徑

腦-腸軸通路 腦-腸軸是大腦和胃腸道之間緊密連接的雙向通路，在調節(jié)胃腸運動功能、機體應激反應及認知等方面起到了重要作用?，F(xiàn)有的大量研究證明了腸道菌群可通過腦-腸軸如神經遞質途徑、免疫途徑、短鏈脂肪酸代謝途徑、microRNA代謝途徑等調節(jié)哺乳動物的行為和情緒，其中神經遞質途徑是研究的焦點。

5-羥色胺通路 5-羥色胺（5-HT）又稱血清素，是一種在哺乳動物中廣泛存在的神經遞質，可調節(jié)宿主認知、情緒等生理活動。已有研究證明梭菌（Clostridiales）可以調節(jié)胃腸道中的5-HT代謝，最新的研究發(fā)現(xiàn)自閉癥譜系障礙（Autism Spectrum Disorder，ASD）小鼠腸道5-HT水平與Blautia菌屬的相對豐度呈明顯正相關，研究者認為Blautia菌屬豐度的降低可能是ASD小鼠腸道中5-HT合成減少的主要原因。因此，5-HT通路可能是腸道菌群調節(jié)宿主行為和情緒的重要途徑之一。

多巴胺通路 多巴胺是一種可由腸道菌群調控的神經遞質。經卒中抑郁患者糞菌移植的大鼠普雷沃菌屬（Prevotella）、顫克桿菌屬（Humicola）豐度相比于正常大鼠明顯降低，單胺類神經遞質測定結果顯示經糞菌移植的大鼠多巴胺、5-HT含量相比于正常大鼠也明顯降低，表明單胺類神經遞質可能參與大鼠卒中抑郁的發(fā)生發(fā)展。另有學者研究發(fā)現(xiàn)，三生合歡飲具有良好的抗抑郁作用，并能調節(jié)抑郁模型小鼠腸道菌群，其多巴胺含量也相應提高，提示腸道菌群可能通過多巴胺通路調節(jié)宿主的行為。

γ-氨基丁酸通路 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是哺乳動物中樞神經系統(tǒng)中的抑制性神經遞質。已有研究發(fā)現(xiàn)，口服GABA具有緩解焦慮、改善睡眠質量、減少應激等積極作用，由此可見，GABA對腦功能和神經活動具有重要的調節(jié)作用。已知乳酸桿菌、雙歧桿菌都能夠參與內源性GABA的合成，腸道菌群可能通過調節(jié)GABA的產生直接作用于腦-腸軸。

四、腸道菌群分析用于導盲犬研究的潛在可能性

腸道菌群研究深入各個領域。事實上，當前對哺乳動物腸道菌群的研究主要基于無菌大鼠和小鼠模型的實驗，另有學者在豬、犬等其他動物的腸道菌群研究領域也取得了一定的成果，較為準確地揭示了腸道菌群通過復雜的神經遞質途徑對哺乳動物的行為和情緒等方面的積極影響。然而，關于導盲犬的腸道菌群研究目前在國內外未見報道。犬的行為和情緒與其神經類型密切相關，腸道菌群可能通過神經遞質途徑對犬神經類型產生影響。因此，我們能夠以篩選導盲犬的關鍵因素（神經類型）為切入點，初探腸道菌群對導盲犬篩選及培訓的影響。

犬腸道菌群分析。一方面，通過DGGE、高通量測序等實驗分析導盲犬與淘汰犬的腸道菌群，尋找出兩組差異明顯的特定菌種，可能作為神經類型篩選的微生物學指標；另一方面，通過生化檢測實驗分析兩組5-HT、多巴胺、GABA等神經遞質，若其差異與菌種差異明顯相一致，則能在很大程度上證明腸道菌群對培訓成功率的影響，后續(xù)實驗可深入探究其具體機制和作用途徑。

通過調節(jié)腸道菌群改善犬的神經類型。目前學界普遍認為膳食中合理補充益生菌和益生元是最廣泛地用以輔助調節(jié)腸道微生物群的方式，益生菌治療在改善哺乳動物焦慮、抑郁等異常行為和情緒方面具有顯而易見的積極作用，因此益生菌治療用于幼犬可能改善其腸道菌群結構和組成，調節(jié)腸道菌群失衡引起的各類胃腸道疾病與神經系統(tǒng)功能異常，最終使幼犬的神經類型向著有利于導盲犬培訓的預期方向發(fā)展，從而有助于提高培訓成功率。值得注意的是，有研究人員發(fā)現(xiàn)，無菌小鼠在生命早期接觸腸道菌群后將與正常小鼠具有相似的行為及基因表達，而當無菌小鼠成年后再重建腸道菌群則無法改變其行為，這意味著利用調節(jié)腸道菌群的方法治療小鼠功能障礙可能存在一段最適時間段，此結論在導盲犬中可能同樣適用。

五、總結與展望

我國的導盲犬事業(yè)經歷十余年的發(fā)展，現(xiàn)已取得了驕人的成果。但不可否認的是，相比于實際需要的巨大缺口，如何解決我國當前導盲犬培訓成功率低的問題顯得至關重要。雖然目前尚未有研究報道直接證明腸道菌群對導盲犬培訓成功率的影響，但是基于目前的哺乳動物模型研究和臨床研究結果，其結論的正確性具備有力的理論依據(jù)的支持。將腸道菌群或神經遞質產物作為預測導盲犬培訓成功率的雙重指標，不僅操作簡單易行，還可大大減少培訓成本，提早淘汰有不可矯正性格和行為的犬；與此同時，利用益生菌治療有利于維持幼犬腸道微生態(tài)平衡，改善其抑郁、焦慮、狂躁、過度興奮等異常行為和情緒，進而有助于提高導盲犬的培訓成功率，為我國廣大的視障人士帶去福音。目前本課題組正在開展這方面的研究。隨著研究的不斷深入，我們堅信未來可以尋找到更多科學嚴謹、實際可行的方法來幫助導盲犬事業(yè)的發(fā)展與進步。