干酪乳桿菌SY13及其合生元對(duì)小鼠腸道中Akkermansia muciniphila豐度的影響

提盼盼,汪建明,*,逄曉陽,呂加平

(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

Akkermansiamuciniphila是一種腸道厭氧菌,疣微菌門,革蘭氏陰性,無鞭毛,不產(chǎn)芽孢,最適生長(zhǎng)溫度37 ℃,最適pH是6.5[1],有研究發(fā)現(xiàn)該菌與嚴(yán)格厭氧菌相比,具有一定的耐氧性[2-3]。該菌早在2004年就被發(fā)現(xiàn),但一直沒有研究其在腸道內(nèi)的功能和作用,直到2013年發(fā)現(xiàn)，該菌在腸道內(nèi)的豐度與宿主肥胖癥、Ⅱ型糖尿病[4]有明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系,這引起了學(xué)界對(duì)該菌的極大關(guān)注。隨著研究的深入,逐漸發(fā)現(xiàn)該菌與人類的炎癥性腸病[5]、克羅恩病[6]、闌尾炎[7]、自閉癥[8-10]、葡萄糖不耐癥[11]、動(dòng)脈粥樣硬化[12]等很多慢性代謝性疾病都有密切關(guān)系,甚至能抑制腸道腫瘤的形成[13],該菌已成為研究熱點(diǎn)。

國(guó)外對(duì)Akkermansiamuciniphila研究較早,已獲得大量數(shù)據(jù),如它在人體腸道中的豐度隨年齡增長(zhǎng)而變化,在老齡人群中的豐度顯著降低[14];該菌能夠緩解酒精性脂肪肝[15];與正常非肥胖小鼠相比,肥胖小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的含量很低[16],與健康小鼠相比,Ⅱ型糖尿病小鼠體內(nèi)Akkermansiamuciniphila的含量也較低[17]等一系列研究。但是國(guó)內(nèi)對(duì)Akkermansiamuciniphila的研究卻很少,對(duì)于該菌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究少之又少,處于一種起步研究階段。

直接服用Akkermansiamuciniphila來預(yù)防和治療慢性代謝疾病是一種簡(jiǎn)單、直接的方法,但是由于目前的法律法規(guī)限制，無法產(chǎn)業(yè)應(yīng)用,因此現(xiàn)階段圍繞Akkermansiamuciniphila的研究重點(diǎn)大多集中在尋找能夠促進(jìn)該菌生長(zhǎng),且可食用的益生菌或益生元,通過益生菌或益生元提高腸道中Akkermansiamuciniphila的豐度,改善機(jī)體的健康狀況,這是目前產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的一條有效途徑。本團(tuán)隊(duì)前期通過大量實(shí)驗(yàn)篩選出了體外能夠促進(jìn)Akkermansiamuciniphila生長(zhǎng)的刺激因子,但生長(zhǎng)刺激因子進(jìn)入宿主腸道后,是否對(duì)該菌有較好的刺激作用是一直關(guān)注的問題。

干酪乳桿菌SY13(LactobacilluscaseiSY13)屬于乳桿菌屬,革蘭氏陽性,不產(chǎn)芽孢,不運(yùn)動(dòng),最適生長(zhǎng)溫度37 ℃。該菌分離自我國(guó)牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品,具有較強(qiáng)的抗氧化和腸道粘附能力[18]。研究已證實(shí),粘附在腸道粘膜上的乳酸菌能夠通過自身代謝產(chǎn)生一些生物活性物質(zhì)來調(diào)節(jié)腸道菌群,抑制有害菌及外源致病菌的生長(zhǎng),為腸道有益菌營(yíng)造一個(gè)健康的生長(zhǎng)環(huán)境[19]。干酪乳桿菌SY13進(jìn)入腸道后具有較強(qiáng)的腸粘膜黏附能力,但SY13是否能夠刺激腸粘膜上Akkermansiamuciniphila的生長(zhǎng)是一個(gè)值得關(guān)注的問題。本研究將干酪乳桿菌及其與益生元組成的合生元進(jìn)行小鼠飼喂實(shí)驗(yàn),利用熒光定量PCR檢測(cè)小鼠腸道內(nèi)Akkermansiamuciniphila的豐度變化,篩選能夠刺激Akkermansiamuciniphila生長(zhǎng)的最佳組合,為后續(xù)通過口服益生菌或合生元來調(diào)節(jié)腸道菌群,最終實(shí)現(xiàn)預(yù)防或治療肥胖、Ⅱ型糖尿病等慢性代謝性疾病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可號(hào)為:SCXK(京)2016-0011;干酪乳桿菌SY13 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品微生物實(shí)驗(yàn)室;Akkermansiamuciniphila(菌株編號(hào):ATCC BAA-835)ATCC美國(guó)菌種保藏中心;大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞 北京全式金生物技術(shù)有限公司;乳果糖 上海源葉生物技術(shù)有限公司，純度99%;低聚果糖 上海源葉生物技術(shù)有限公司，純度98%;TransStart? Probe qPCR SuperMix 北京全式金生物技術(shù)有限公司;TIANamp Stool DNA Kit(DP328) 天根生化科技(北京)有限公司;MRS肉湯(CM187) 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;NaCl(AR) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;LDZX-50KB型 立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠;HDL型超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;3K15型離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;TP600型PCR儀 寶生物工程(大連)有限公司;熒光定量PCR儀(7500) 美國(guó)ABI公司;DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠;DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;MB-102振蕩型恒溫金屬浴 杭州博日科技有限公司;多功能酶標(biāo)儀(SPARK 20M) 帝肯(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 益生菌及合生元的制備

1.2.1.1 干酪乳桿菌SY13菌粉的制備 凍干保護(hù)劑的選用參考曾小群等[20]的研究,本文采用真空冷凍干燥法來凍干菌粉,保護(hù)劑選用10%的脫脂乳添加終濃度為0.1%的谷氨酸鈉,滅菌備用。

在離心洗滌干凈的菌沉淀中加入凍干保護(hù)劑,混勻后在-80 ℃冰箱中預(yù)凍4～6 h,最后在冷阱溫度-57 ℃,真空度為15.3 Pa條件下,真空冷凍干燥24 h。

1.2.1.2 合生元的制備 將制備好的SY13菌粉用無菌水進(jìn)行溶解,得到SY13的活菌數(shù)為3.3×109cfu/mL的SY13制劑;將SY13菌粉用無菌水溶解,再加入低聚果糖或者乳果糖的無菌溶液,得到SY13活菌數(shù)為3.3×109cfu/mL、低聚果糖濃度為50 mg/mL SY13的低聚果糖合生元,以及SY13活菌數(shù)為3.3×109cfu/mL、乳果糖濃度為50 mg/mL的SY13乳果糖合生元。

1.2.2 計(jì)算干酪乳桿菌SY13活菌數(shù) 活菌計(jì)數(shù)參考GB 4789.2-2016[21]。將凍干的SY13菌粉于MRS肉湯培養(yǎng)基中37 ℃活化培養(yǎng)48 h,將活化好的菌液用0.85%的無菌生理鹽水倍比稀釋到10-8,每個(gè)MRS平皿涂布1 mL稀釋菌液,每個(gè)稀釋度三個(gè)重復(fù),平皿倒置在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40～48 h,然后進(jìn)行平板計(jì)數(shù),計(jì)算出SY13所制得的菌粉活菌數(shù)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及腸道內(nèi)容物基因組提取方法

1.2.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 飼喂方式采用灌胃法。8周齡小鼠和9個(gè)月齡小鼠各96只,實(shí)驗(yàn)分為AP組、AO組、BP組、BO組,每組48只。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組又分為對(duì)照組,記為1;干酪乳桿菌SY13組,記為2;SY13低聚果糖組,記為3;SY13乳果糖組,記為4,每組12只。在灌胃之前,小鼠自由飲水與采食,以適應(yīng)環(huán)境,7 d后,進(jìn)行灌胃實(shí)驗(yàn),分組情況見表1。

表1 小鼠分組

1.2.3.2 腸道內(nèi)容物基因組提取方法 在灌胃結(jié)束后的第1、3、5、7 d處死小鼠,每次每組處死3只,快速收集小鼠的空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸,放在2 mL的凍存管,置于液氮中保存。

應(yīng)用天根試劑盒TIANamp Stool DNA Kit(DP328)對(duì)小鼠各腸道內(nèi)容物進(jìn)行提取基因組實(shí)驗(yàn)。具體步驟參照賈子陽[22]腸道內(nèi)容物基因組提取方法。提取出的DNA保存在-20 ℃?zhèn)溆?作為后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR模板使用。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)Akkermansiamuciniphila方法的建立

1.2.4.1 引物和TaqMan-TAMRA探針設(shè)計(jì) 用Beacon Designer 7.0進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)出的引物命名為:上游引物06678F;下游引物06678R;TaqMan-TAMRA探針命名為06678P。引物和探針于北京華大基因合成。

1.2.4.2 TaqMan TAMRA探針RT-PCR反應(yīng)條件 熒光定量PCR反應(yīng)總體積為20 μL,由1 μL上游引物06678F(10 pmol),1 μL下游引物06678R(10 pmol),1 μL TaqMan-TAMRA探針06678P(10 pmol),1 μL模板DNA,10 μL的2×(ABI的mix:TaqMan? Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems,USA))Transtart@Probe qPCR SuperMix和6 μL無菌雙蒸水。TaqMan TAMRA探針RT-PCR的反應(yīng)程序包括酶激活階段50 ℃ 2 min，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s,62 ℃退火1 min,72 ℃延伸60 s,40個(gè)循環(huán)。在退火階段采集熒光信號(hào),以CT值表示最后結(jié)果。

CT值越小,對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)越低,說明樣品中的模板DNA含量就越高,CT值與樣品中的模板DNA含量呈負(fù)相關(guān)。一般情況下,CT值大于36就可以說明樣品中的目的DNA含量微乎其微,可以忽略不計(jì)[23]。

1.2.5 小鼠腸道樣品的分析

1.2.5.1 合生元對(duì)小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的影響 取小鼠灌胃結(jié)束后第1 d的空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸,提取腸道內(nèi)容物的基因組,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行分析,根據(jù)SY13及其合生元對(duì)單次灌胃下青年鼠、單次灌胃下老年鼠、長(zhǎng)期灌胃下青年鼠、長(zhǎng)期灌胃下老年鼠四組數(shù)據(jù)的分析,得出對(duì)小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila生長(zhǎng)刺激效果最好的灌胃組合。

1.2.5.2 灌胃時(shí)間對(duì)小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的影響 取小鼠灌胃結(jié)束后第1 d的空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸,提取腸道內(nèi)容物的基因組,以腸道內(nèi)容物基因組為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)物熒光定量PCR,對(duì)PCR的結(jié)果進(jìn)行分析,根據(jù)對(duì)單次灌胃下與長(zhǎng)期灌胃下的PCR結(jié)果分析,得出灌胃時(shí)間對(duì)小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的刺激效果。

1.2.5.3 年齡對(duì)小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的影響 取小鼠灌胃結(jié)束后第1 d的空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸,提取腸道內(nèi)容物基因組,以腸道內(nèi)容物基因組為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行分析,根據(jù)對(duì)青年鼠與老年鼠的PCR結(jié)果分析,得出年齡對(duì)小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila豐度的影響。

1.2.5.4 小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的保留時(shí)間 由Derrien等[24]的研究可知,小鼠盲腸中Akkermansiamuciniphila的含量要多余其他部位,故以小鼠盲腸為例,取小鼠灌胃結(jié)束后第1、3、5、7 d的小鼠盲腸,提取盲腸內(nèi)容物基因組,以提取的基因組為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量,對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行分析,根據(jù)灌胃結(jié)束后的不同時(shí)間內(nèi)Akkermansiamuciniphila在腸道中豐度的變化,找到影響Akkermansiamuciniphila在腸道中保留時(shí)間的因素。

1.3 數(shù)據(jù)處理

差異顯著性分析采用Statistix 8.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,文中的圖表均是用Origin 8.0進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針

用Beacon Designer 7.0設(shè)計(jì)出引物與探針。引物和探針序列見表3,通用的測(cè)序引物為M13-47和M13-48。

表2 擴(kuò)增引物和Taqman-TAMRA 探針

2.2 Akkermansia muciniphila豐度的變化規(guī)律

2.2.1 合生元對(duì)小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的影響

2.2.1.1 單次灌胃合生元對(duì)青年小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的影響 由表3可知,AP1組未檢出熒光信號(hào),即循環(huán)數(shù)達(dá)到設(shè)定最大CT值40時(shí),仍未檢測(cè)到熒光信號(hào),說明模板中沒有Akkermansiamuciniphila的DNA,AP2組與AP3組的之間沒有顯著性差異(p>0.05),而均與AP4組有顯著性差異(p<0.05),且AP4組的CT值顯著低于其他組(p<0.05)。有研究表明,乳果糖在人體中不易被消化吸收,但能在腸道菌群的作用下分解成小分子的有機(jī)酸[25],這些有機(jī)酸也許是Akkermansiamuciniphila生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。結(jié)果表明，SY13、SY13低聚果糖、SY13乳果糖均能提高青年小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的豐度,以SY13乳果糖的效果最為顯著(p<0.05),說明SY13乳果糖對(duì)青年小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila生長(zhǎng)的刺激效果最佳。

表3 單次灌胃合生元的青年小鼠腸道中Akkermansia muciniphila的分布

2.2.1.2 單次灌胃合生元對(duì)老年小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的影響 由表4可知,AO1組未檢出熒光信號(hào),說明CT值大于等于40,說明模板中沒有Akkermansiamuciniphila的DNA,AO2組與AO3組的之間沒有顯著性差異,但是卻均與AO4組有顯著性差異(p<0.05),且AO4組的CT值顯著低于其他組(p<0.05),實(shí)驗(yàn)結(jié)果同表3中的青年小鼠結(jié)果趨勢(shì)一致。結(jié)果表明SY13、SY13低聚果糖、SY13乳果糖均能提高青年小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的豐度,以SY13乳果糖的效果最為顯著,說明合生元中SY13乳果糖對(duì)老年小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila豐度的提高效果最佳。

表4 單次灌胃合生元的老年小鼠腸道中Akkermansia muciniphila的分布

2.2.1.3 長(zhǎng)期灌胃合生元對(duì)青年小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的影響 由表5可知,BP1組未檢出熒光信號(hào),說明CT值大于等于40,模板中Akkermansiamuciniphila的DNA可忽略不計(jì),盲腸內(nèi)容物基因組的CT值,BP2組與BP3組的之間沒有顯著性差異(p>0.05),但是卻均與BP4組有顯著性差異(p<0.05);結(jié)腸內(nèi)容物基因組CT值,BP3組與BP2組和BP4組均無顯著性差異(p>0.05),但BP2組與BP4組有顯著性差異(p<0.05),且BP4組的CT值顯著低于其他組(p<0.05)。結(jié)果表明SY13、SY13低聚果糖、SY13乳果糖均能提高青年小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的豐度,以SY13乳果糖的效果最為顯著,說明SY13乳果糖對(duì)青年小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila豐度的提高效果最佳。

表5 長(zhǎng)期灌胃合生元的青年小鼠腸道中Akkermansia muciniphila的分布

2.2.1.4 長(zhǎng)期灌胃合生元對(duì)老年小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的影響 由表6可知,BO1組未檢出熒光信號(hào),說明CT值大于等于40,此時(shí)模板中Akkermansiamuciniphila的DNA含量很低,可忽略不計(jì),盲腸內(nèi)容物基因組的CT值,BO2組與BO3組的沒有顯著性差異(p>0.05),但均與BO4組有顯著性差異(p<0.05);結(jié)腸內(nèi)容物基因組的CT值,BO3組與BO4組沒有顯著性差異(p>0.05),但是均與BO2組有顯著性差異(p<0.05)。結(jié)果表明,SY13、SY13低聚果糖、SY13乳果糖均能提高老年小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的豐度,CT值是SY13組>SY13低聚果糖組>SY13乳果糖組,故Akkermansiamuciniphila的豐度是SY13組

表6 長(zhǎng)期灌胃合生元的老年小鼠腸道中Akkermansia muciniphila的分布

由表3～表6可知,無論是青年小鼠還是老年小鼠,單次灌胃還是長(zhǎng)期灌胃,SY13及其合生元中對(duì)小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila生長(zhǎng)刺激效果最好的均是SY13乳果糖。

2.2.2 年齡對(duì)小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila豐度的影響 由表3和表4可知,單次灌胃下,青年組的CT值顯著低于老年組(p<0.05),同樣,由表5和表6可知,長(zhǎng)期灌胃下,青年組的CT值顯著低于老年組(p<0.05),說明年齡對(duì)Akkermansiamuciniphila豐度的影響也較大,鼠齡越低,Akkermansiamuciniphila的豐度越高。

2.2.3 灌胃時(shí)間對(duì)小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila豐度的影響 由表3和表5可知,單次灌胃下的青年鼠和長(zhǎng)期灌胃下的青年鼠CT值有顯著性的差異(p<0.05),同理,由表4和表6可知,單次灌胃下的老年鼠和長(zhǎng)期灌胃下的老年鼠CT值有顯著性的差異(p<0.05),說明灌胃時(shí)間對(duì)腸道內(nèi)Akkermansiamuciniphila豐度的影響很大,灌胃時(shí)間越長(zhǎng),小鼠腸道內(nèi)Akkermansiamuciniphila的豐度越高。

2.2.4 合生元處理下Akkermansiamuciniphila在小鼠盲腸中保留時(shí)間的變化

2.2.4.1 單次灌胃下青年小鼠盲腸中Akkermansiamuciniphila豐度隨時(shí)間的變化 由圖1可知,對(duì)照組在灌胃結(jié)束后的第1、3、5、7 d的CT值均大于等于40(CT值≥40,為了在圖中顯示出對(duì)照組數(shù)據(jù),統(tǒng)一將未檢測(cè)出熒光值標(biāo)記為CT值為40,圖2、圖3、圖4同圖1),SY13及其合生元組的CT值在前3 d呈緩慢上升趨勢(shì),到第5 d達(dá)到和對(duì)照組相同的CT值,說明在灌胃結(jié)束后的3 d內(nèi)均能檢測(cè)到Akkermansiamuciniphila的存在,且CT值是SY13乳果糖組SY13低聚果糖組>SY13組,但在第5 d后均未檢測(cè)到熒光信號(hào),說明在停止灌胃后第5 dAkkermansiamuciniphila豐度又降低到檢測(cè)不到的水平,可能是因?yàn)橥Ｖ构辔负骃Y13及其合生元為Akkermansiamuciniphila提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)急劇降低,導(dǎo)致Akkermansiamuciniphila的豐度降低。結(jié)果表明，單次灌胃下,SY13乳果糖組對(duì)青年小鼠腸道Akkermansiamuciniphila的生長(zhǎng)促進(jìn)效果最佳,但是Akkermansiamuciniphila只有在停止灌胃小于5 d內(nèi)能被檢測(cè)到。

圖1 單次灌胃停止后青年小鼠盲腸中Akkermansia muciniphila隨時(shí)間的變化

2.2.4.2 單次灌胃下老年小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila保留時(shí)間的變化 由圖2可知,單次灌胃下老年小鼠盲腸Akkermansiamuciniphila與單次灌胃下青年小鼠趨勢(shì)一致,對(duì)照組在灌胃結(jié)束后的第1、3、5、7 d的CT值均大于等于40,SY13及其合生元組的CT值在前3 d呈緩慢上升趨勢(shì),直到第5 d達(dá)到和對(duì)照組相同的CT值,說明在停止灌胃后的第5 d時(shí)Akkermansiamuciniphila豐度又降低到檢測(cè)不到的水平。結(jié)果表明，單次灌胃下,SY13乳果糖組對(duì)老年小鼠腸道Akkermansiamuciniphila的生長(zhǎng)促進(jìn)效果最佳,但是Akkermansiamuciniphila只有在停止灌胃小于5 d內(nèi)能被檢測(cè)到。

圖2 單次灌胃停止后老年小鼠盲腸中Akkermansia muciniphila隨時(shí)間的變化

2.2.4.3 長(zhǎng)期灌胃下青年小鼠盲腸中Akkermansiamuciniphila保留時(shí)間的變化 由圖3可知,對(duì)照組在灌胃結(jié)束后的第1、3、5、7 d的CT值均大于等于40,SY13及其合生元組的CT值呈緩慢上升趨勢(shì),第7 d仍能檢測(cè)到Akkermansiamuciniphila的存在,前3 d的SY13組CT值略高于SY13低聚果糖組,但是在第5 d兩組的CT值幾乎達(dá)到相同的水平,第7 d時(shí)SY13組的CT值略低于SY13低聚果糖組,此過程中SY13乳果糖組始終低于其他組,到第7 d時(shí)三組水平接近?？赡苁怯捎诠辔笗r(shí)SY13與低聚果糖組合及SY13乳果糖組合對(duì)Akkermansiamuciniphila的促進(jìn)效果要強(qiáng)于SY13單獨(dú)作用,在停止灌胃后,低聚果糖及乳果糖水平急劇下降,Akkermansiamuciniphila能利用的只剩之前灌胃的SY13的作用,故三組水平趨于一致,至于SY13乳果糖組CT值明顯低于其他兩組可能是由于乳果糖對(duì)Akkermansiamuciniphila的生長(zhǎng)促進(jìn)效果比低聚果糖好。結(jié)果表明，長(zhǎng)期灌胃下,SY13乳果糖組對(duì)青年小鼠腸道Akkermansiamuciniphila的生長(zhǎng)促進(jìn)效果最佳,其次是SY13低聚果糖組和SY13組,但是隨著時(shí)間的推移,三組水平逐漸趨于SY13組水平。

圖3 長(zhǎng)時(shí)間灌胃停止后青年小鼠盲腸中Akkermansia muciniphila隨時(shí)間的變化

2.2.4.4 長(zhǎng)期灌胃下老年小鼠盲腸中Akkermansiamuciniphila保留時(shí)間的變化 由圖4所知,長(zhǎng)期灌胃下老年小鼠盲腸中Akkermansiamuciniphila的豐度變化與長(zhǎng)期灌胃下青年小鼠的變化趨勢(shì)一致,對(duì)照組在灌胃結(jié)束后的第1、3、5、7 d的CT值均大于等于40,SY13及其合生元組的CT值呈緩慢上升趨勢(shì),第7 d仍能檢測(cè)到Akkermansiamuciniphila的存在,且在第7 d時(shí)水平趨于SY13組水平,可能原因同2.2.4.3。結(jié)果表明，長(zhǎng)期灌胃下,SY13乳果糖組對(duì)老年小鼠腸道Akkermansiamuciniphila的生長(zhǎng)促進(jìn)效果最佳,其次是SY13低聚果糖組和SY13組,但是隨著時(shí)間的推移,三組水平逐漸趨于SY13組水平。

圖4 長(zhǎng)時(shí)間灌胃停止后老年小鼠盲腸中Akkermansia muciniphila隨時(shí)間的變化

2.2.4.5 鼠齡和灌胃項(xiàng)對(duì)小鼠盲腸中Akkermansiamuciniphila保留時(shí)間的影響 由圖1～圖2可知,單次灌胃下,無論是青年小鼠還是老年小鼠、不同的灌胃項(xiàng),在停止灌胃后的第5 d就已經(jīng)不能檢測(cè)到Akkermansiamuciniphila的存在,說明單次灌胃下,Akkermansiamuciniphila在腸道中的保留時(shí)間不會(huì)超過5 d。由圖3～圖4可知,長(zhǎng)期灌胃下,無論是青年小鼠還是老年小鼠、不同的灌胃項(xiàng),在停止灌胃后的第7 d仍能檢測(cè)到Akkermansiamuciniphila的存在,故長(zhǎng)期灌胃下,Akkermansiamuciniphila在腸道中的保留時(shí)間至少為7 d。結(jié)果表明，鼠齡和灌胃項(xiàng)對(duì)小鼠盲腸中Akkermansiamuciniphila的保留時(shí)間基本無影響,而灌胃時(shí)間對(duì)小鼠盲腸中Akkermansiamuciniphila的保留時(shí)間有顯著的影響。

3 結(jié)論

本研究通過小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),干酪乳桿菌SY13、SY13-低聚果糖和SY13-乳果糖對(duì)小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的豐度均有顯著的促進(jìn)作用,其中,以SY13-乳果糖效果最為顯著。乳果糖在人體中不能進(jìn)一步水解,不易被消化吸收,進(jìn)食后直接進(jìn)入結(jié)腸,并在腸道菌群的作用下分解成小分子的有機(jī)酸[25],這些小分子的有機(jī)酸很有可能是Akkermansiamuciniphila生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。此外,乳果糖在降解為有機(jī)酸的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生二氧化碳和水,軟化糞便,刺激腸道蠕動(dòng),緩解便秘,對(duì)便秘型腸易激綜合征有一定的療效[26],由于Akkermansiamuciniphila與肥胖有關(guān),而便秘與肥胖有著不可分割的關(guān)系,故乳果糖很有可能是通過緩解便秘而間接對(duì)Akkermansiamuciniphila的豐度產(chǎn)生影響的。SY13粘附在腸粘膜上,通過自身代謝產(chǎn)生的一些生物活性物質(zhì),為腸道有益菌營(yíng)造一個(gè)健康的生長(zhǎng)環(huán)境[19],這可能是Akkermansiamuciniphila豐度提高的一個(gè)環(huán)境因素。

本文通過比較益生菌SY13、SY13-低聚果糖與SY13-乳果糖在體內(nèi)對(duì)于Akkermansiamuciniphila豐度的影響,發(fā)現(xiàn)SY13-乳果糖對(duì)小鼠腸道中Akkermansiamuciniphila的促進(jìn)效果最為顯著,且鼠齡越小,灌胃時(shí)間越長(zhǎng),該菌的豐度就越高,同時(shí),灌胃時(shí)間越長(zhǎng),Akkermansiamuciniphila的保留時(shí)間就越長(zhǎng),這與鼠齡和灌胃項(xiàng)無關(guān)。這為今后預(yù)防和治療肥胖癥、Ⅱ型糖尿病等一系列代謝性疾病奠定了重要的理論基礎(chǔ),具有重要意義。

[1]Derrien M,Vaughan E E,Plugge C M,et al. Akkermansia muciniphila gen. nov.,sp. nov.,a human intestinal mucin-degrading bacterium[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2004,54(5):1469-1476.

[2]Ouwerkerk J P,Van Der Ark K C,DAVIDS M,et al. Adaptation of Akkermansia muciniphila to the oxic-anoxic interface of the mucus layer[J]. Applied Environmental Microbiology,2016,82(23):6983-6993.

[3]Van Passel M W,Kant R,Zoetendal E G,et al.The genome of Akkermansia muciniphila,a dedicated intestinal mucin degrader,and its use in exploring intestinal metagenomes[J]. PLoS One,2011,6(3):e16876.

[4]Yassour M,Lim M Y,Yun H S,et al. Sub-clinical detection of gut microbial biomarkers of obesity and type 2 diabetes[J]. Genome Medicine,2016,8(1):17.

[5]Derrien M,Belzer C,De Vos W M.Akkermansia muciniphila and its role in regulating host functions[J]. Microb Pathog,2016,106(1):171-181.

[6]Weir T L,Manter D K,Sheflin A M,et al. Stool microbiome and metabolome differences between colorectal cancer patients and healthy adults[J]. PLoS One,2013,8(8):e70803.

[7]Swidsinski A,Dorffel Y,Loening-Baucke V,et al. Acute appendicitis is characterised by local invasion with Fusobacterium nucleatum/necrophorum[J]. Gut,2011,60(1):34-40.

[8]Li Q,Han Y,Dy A B C,et al. The Gut Microbiota and Autism Spectrum Disorders[J]. Front Cell Neurosci,2017,9(2):11:120.

[9]Reunanen J,Kainulainen V,Huuskonen L,et al. Akkermansia muciniphila Adheres to Enterocytes and Strengthens the Integrity of the Epithelial Cell Layer[J]. Applied Environmental Microbiology,2015,81(11):362-365.

[10]Wang L,Christophersen C T,Sorich M J,et al. Low relative abundances of the mucolytic bacterium Akkermansia muciniphila and Bifidobacterium spp. in feces of children with autism[J]. Applied Environmental Microbiology,2011,77(18):6718-6721.

[11]Ellekilde M,Krych L,Hansen C H,et al. Characterization of the gut microbiota in leptin deficient obese mice-Correlation to inflammatory and diabetic parameters[J]. Research in Veterinary Science,2014,96(2):241-50.

[12]Li J,Lin S,Vanhoutte P M,et al. Akkermansia Muciniphila Protects Against Atherosclerosis by Preventing Metabolic Endotoxemia-Induced Inflammation in Apoe-/-Mice[J]. Circulation,2016,133(24):2434-2446.

[13]Dingemanse C,Belzer C,Van Hium S A,et al. Akkermansia muciniphila and Helicobacter typhlonius modulate intestinal tumor development in mice[J]. Carcinogenesis,2015,36(11):1388-1396.

[14]Collado M C,Derrien M,Isolauri E,et al. Intestinal integrity and Akkermansia muciniphila,a mucin-degrading member of the intestinal microbiota present in infants,adults,and the elderly[J].Applied Environinental Microbiology,2007,73(23):767-770.

[15]Grander C,Adolph Te,Wieser V,et al.Recovery of ethanol-induced Akkermansia muciniphila depletion ameliorates alcoholic disease[J]. Gut,2017,10(7):1-11.

[16]Everard A,Belzer C,Geurts L,et al. Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity[J]. PNAS,2013,110(22):9066-9071.

[17]Hansen C H,Krych L,Nielsen D S,et al. Early life treatment with vancomycin propagates Akkermansia muciniphila and reduces diabetes incidence in the NOD mouse[J]. Diabetologia,2012,55(8):2285-2294.

[18]張書文,呂加平,孟和畢力格. 等. 干酪乳桿菌干酪亞種Lactobacillus casei subsp. casei SY13對(duì)衰老模型小鼠的抗氧化作用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(10):2141-2146.

[19]趙迪,曾娟娟,王蕾,等. 干酪乳桿菌功能及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī),2015,(3):56-58. 2015.0173.

[20]曾小群,潘道東,包紅燕,等. 干酪乳桿菌凍干保護(hù)劑研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2013,13(1):45-50.

[21]GB4789.2-2016,菌落總數(shù)測(cè)定[S]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016.

[22]賈子陽. 干酪乳桿菌SY13粘附屬性研究[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2017.

[23]蔣春燕,王泰健,王琴,等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005,26(12):98-101.

[24]Derrien M,Van Baarlen P,Hooiveld G,et al. Modulation of Mucosal Immune Response,Tolerance,and Proliferation in Mice Colonized by the Mucin-Degrader Akkermansia muciniphila[J]. Front Microbiol,2011,2:166.

[25]黃越前,丁飛躍,鐘冬梅,等. 氣滯胃痛顆粒聯(lián)合乳果糖治療便秘型腸易激綜合征臨床研究[J]. 中醫(yī)學(xué)報(bào),2017,32(225):279-281.

[26]Ulluwishewa D,Anderson R C,McNabb W C,et al. Regulation of Tight Junction Permeability by Intestinal Bacteria and Dietary Components[J]. Journal of Nutrition,2011,141(5):769-776.