脈沖強(qiáng)光誘變保加利亞乳桿菌高產(chǎn)胞外多糖

陶雨施,張佰清

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 110866)

胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)是微生物在成長代謝過程中分泌到細(xì)胞外的呈黏狀或夾膜狀的糖類化合物[1]。乳酸菌是食品級細(xì)菌,乳酸菌胞外多糖具有獨特的物理學(xué)和生物學(xué)特性,可以作為乳化劑、膠凝劑、穩(wěn)定劑應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域。同時因其具有獨特的抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降膽固醇、提高免疫力等生物學(xué)特性逐漸受到人們的重視[2]。然而乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量較低,使其在食品加工中大量使用受到限制。目前,利用誘變技術(shù)選育高產(chǎn)、高活力且穩(wěn)定遺傳的改良菌株已成為研究熱點。常用于提高乳酸菌高產(chǎn)胞外多糖的誘變方法有硫酸二乙酯誘變、亞硝基胍誘變、亞硝酸鈉誘變及紫外光照射等,但這些誘變方法對提高菌株多糖產(chǎn)量的作用普遍不大,且化學(xué)誘變劑的高毒性會對操作者及生態(tài)環(huán)境造成一定威脅[3-4]。

脈沖強(qiáng)光(Intense pulse light,IPL)是一種新型冷處理技術(shù),具有環(huán)保、安全、快捷的特點,可以有效殺死致病菌和腐敗菌,且與連續(xù)紫外線相比,脈沖光操作更簡單、照射時間更短、穿透能力更強(qiáng)[5]。Cheigh等[6]研究發(fā)現(xiàn),脈沖強(qiáng)光會通過產(chǎn)生順式環(huán)丁烷嘧啶二聚體和嘧啶(6-4)嘧啶酮光產(chǎn)物((6-4)PPs)使微生物DNA出現(xiàn)雙鍵斷裂、缺失等損傷,并且當(dāng)這種DNA損傷未被及時修復(fù)就會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生誘變。目前,脈沖強(qiáng)光正逐漸應(yīng)用于優(yōu)良菌株的誘變選育。孟憲軍等[7]用脈沖強(qiáng)光對納塔爾鏈霉素進(jìn)行誘變,選育出突變株SN114,使那他霉素產(chǎn)量較原始株提高了1.6倍。趙春燕等[8]通過脈沖強(qiáng)光誘變得到Nisin高產(chǎn)突變株。張佰清等[9]通過脈沖強(qiáng)光誘變得到多抗性啤酒酵母。

本實驗以產(chǎn)糖菌株保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)IMAU40160為研究對象,利用脈沖強(qiáng)光對其進(jìn)行誘變處理以提高胞外多糖產(chǎn)量,并對突變株多糖的簡單結(jié)構(gòu)和抗氧化活性進(jìn)行分析,最后對脈沖強(qiáng)光誘變機(jī)理進(jìn)行初探。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L.bulgaricusIMAU40160 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程實驗室;苯酚、濃硫酸、鄰苯三酚 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、考馬斯亮藍(lán)、丙烯酰胺、過硫酸銨 北京鼎國試劑公司;脫脂乳粉 完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司;MRS液體和固體培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基 參照馮美琴等[10]的方法配制;蛋白裂解液 參照徐宗凱等[11]的方法配制。

脈沖強(qiáng)光裝置 波長范圍在200～1100 nm,其中紫外光部分占15%～20%,脈沖寬度20 μs,最大輸入能量644 J[12],由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院自制;高壓蒸汽滅菌鍋 上海三申器械有限公司;超凈工作臺 上海博訊有限公司;恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;NDJ-5S粘度計 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司;離心機(jī) Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1L.bulgaricus生長曲線的測定 將凍存菌L.bulgaricusIMAU40160以接種量4%接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h,傳代活化3次?；罨蟮腖.bulgaricusIMAU4016以3%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng),每隔2 h取出,紫外分光光度計測定OD600的吸光值。以時間為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制菌株生長曲線。

1.2.2 脈沖強(qiáng)光誘變處理 用滅菌生理鹽水將生長至對數(shù)期的L.bulgaricusIMAU40160菌體洗滌兩次,并將菌體重新懸浮于生理鹽水中,制成細(xì)胞濃度為105個/mL的菌懸液。將10 mL菌懸液轉(zhuǎn)移到直徑為9 cm的滅菌培養(yǎng)皿中,放入脈沖強(qiáng)光處理室,確保培養(yǎng)皿位于氙燈的正下方,在脈沖電壓1800 V,脈沖距離9 cm的條件下,采用脈沖強(qiáng)光分別照射處理4、7、10、13、16、19次。照射處理后,取100 μL菌懸液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上,37 ℃避光培養(yǎng)48 h后,根據(jù)下列公式計算各照射處理次數(shù)下菌株的致死率和正突變率。

式中:N0-誘變處理前活菌數(shù);N1-誘變處理后活菌數(shù)。

式中:S-正突變菌落數(shù)(突變株EPS產(chǎn)量提高10%視為正突變);U-篩選菌落數(shù)。

1.2.3 高產(chǎn)胞外多糖突變株的篩選

1.2.3.1 初篩 以發(fā)酵乳粘度作為初篩高產(chǎn)胞外多糖突變株的依據(jù)。挑取培養(yǎng)基上的單菌落進(jìn)行活化,活化后以6%的接種量(濃度108個/mL)分別接種于滅菌脫脂乳中,37 ℃發(fā)酵12 h至凝乳。4 ℃下冷藏24 h,粘度計測定發(fā)酵乳粘度,初篩出產(chǎn)粘能力較強(qiáng)的菌株。

1.2.3.2 復(fù)篩 將初篩得到菌株活化后,以6%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃條件下培養(yǎng)24 h制得發(fā)酵液,通過測定發(fā)酵液中多糖含量,篩選出胞外多糖高產(chǎn)突變株。

1.2.3.3 多糖含量的測定及產(chǎn)量的計算 取30 mL發(fā)酵液,加入6 mL的sevag試劑(V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1)混合均勻,4 ℃靜置過夜后,9500 r/min離心20 min,取上清液,蒸餾水透析36 h,每8 h換1次水,得到多糖溶液。參照羅佳等[13]的方法繪制得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=13.631x-0.0136(R2=0.998),式中x為多糖濃度;y為OD490的吸光度。將多糖溶液稀釋10 倍,通過苯酚-硫酸法[14]測定多糖溶液在490 nm處的吸光度,帶入以下公式計算多糖含量。

式中:A-測定值OD490。

1.2.4 粗多糖的制備 取30 mL發(fā)酵液,加入6 mL的sevag試劑(V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1),9500 r/min離心10 min除去菌體和蛋白。將離心后的上清液裝入透析袋中蒸餾水透析36 h。透析液中加入3倍體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇,4 ℃醇沉過夜,多糖呈絮狀沉淀析出,9500 r/min離心10 min,將所得沉淀冷凍干燥即得到粗多糖。

1.2.5 遺傳穩(wěn)定性的測定 將突變株在固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳6代,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,取每一代進(jìn)行發(fā)酵,檢測其胞外多糖產(chǎn)量的穩(wěn)定性。

1.2.6 傅里葉紅外光譜分析 取1 mg粗多糖樣品與適量KBr混合,壓片制樣,使用紅外光譜儀在500～4000 cm-1的頻率范圍內(nèi)進(jìn)行掃描分析。

1.2.7 掃描電鏡分析 粗多糖樣品用雙面膠固定,噴金,高真空模式下進(jìn)行掃描電子顯微鏡測定,工作電壓12.5 kV,放大倍數(shù)為1000。

1.2.8 抗氧化分析

式中:A0-蒸餾水代替樣品的吸光度;A1-多糖樣液和反應(yīng)液的吸光度。

1.2.8.2 羥基自由基(·OH)清除能力的測定 羥基自由基的測定參照Seedevi等[16]的方法。取 1 mL不同濃度的多糖溶液(0.2～1.0 mg/mL),依次加入2 mL(1.0 mmoL/mL)的FeSO4,1 mL(1.8 mmoL/mL)的水楊酸-乙醇溶液,0.1 mL的0.3%的H2O2溶液啟動反應(yīng)。37 ℃水浴反應(yīng)30 min,510 nm處測定吸光度。蒸餾水作為空白。每個濃度的樣品做三個平行,取平均值計算清除率。清除率采用以下公式進(jìn)行計算:

式中:A0-蒸餾水代替樣品的吸光度;A1-多糖樣液和反應(yīng)液的吸光度。

1.2.9 SDS-PAGE凝膠電泳分析 菌體蛋白的提取:取適量菌體發(fā)酵液,無菌水洗滌三次,9500 r/min 4 ℃離心10 min收集菌體沉淀。加入1000 μL裂解液進(jìn)行超聲破碎,超聲條件為振4 s,停4 s,處理功率43%,超聲處理30 min后,12000 r/min離心30 min收集上清液,即蛋白溶液。

SDS-PAGE凝膠電泳:蛋白電泳操作方法參照文獻(xiàn)[17]。其中分離膠濃度為12%,濃縮膠為5%。濃縮膠處理電壓80 V,分離膠處理電壓90 V,電泳完成后依次對膠體進(jìn)行固定,染色,脫色處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均平行測定三次,測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示,使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. bulgaricus IMAU40160的生長曲線

L.bulgaricusIMAU40160出發(fā)株生長曲線如圖1所示,0～2 h內(nèi)菌株處于延遲生長期,2～10 h處于對數(shù)生長期,10 h后菌株生長進(jìn)入穩(wěn)定期。誘變處理一般選取對數(shù)生長中后期的菌株,此時的菌株對誘變劑更為敏感,容易發(fā)生變異且重復(fù)性更好[18]。因此實驗選取8 h的菌株進(jìn)行誘變處理。

圖1 L. bulgaricus IMAU40160 出發(fā)株的生長曲線

2.2 脈沖強(qiáng)光誘變劑量的確定

在不同脈沖次數(shù)條件下對原始菌株進(jìn)行誘變處理,考察菌株的正突變率與致死率。如圖2所示,脈沖處理10次時正突變率達(dá)到最大。這可能是由于脈沖光的光化學(xué)效應(yīng)使菌體DNA發(fā)生雙鍵斷裂或缺失,影響了DNA的轉(zhuǎn)錄翻譯過程而使菌株發(fā)生突變[19]。隨著脈沖次數(shù)的繼續(xù)增加,菌株的致死率逐漸增強(qiáng),在脈沖次數(shù)10 次時,致死率達(dá)到78.9%;脈沖次數(shù)19次時,菌株的致死率達(dá)到98.8%。這是由于脈沖光的光化學(xué)效應(yīng)與脈沖次數(shù)呈正相關(guān)作用,當(dāng)脈沖次數(shù)達(dá)到一定程度后,光化學(xué)效應(yīng)所表現(xiàn)出的致死作用會使菌體大量死亡,且不利于正突變的形成[20]。在脈沖次數(shù)10次時,其致死率為78.9%,正突變率達(dá)到最大值16.7%,此條件更有利于篩選工作的進(jìn)行和正突變株的形成。因此,選取10 次為最佳脈沖次數(shù),并在此條件下對菌株進(jìn)行誘變處理。

圖2 脈沖強(qiáng)光對L. bulgaricus致死率和正突變率的影響

2.3 EPS高產(chǎn)菌株的篩選

2.3.1 發(fā)酵乳粘度初篩 胞外多糖高產(chǎn)突變株的初篩結(jié)果如圖3所示,不同突變株的產(chǎn)粘能力不同。唐艷等[21]研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌的胞外多糖產(chǎn)量與其發(fā)酵乳粘度呈正相關(guān)關(guān)系。因此,實驗選取粘度較原始株顯著提高(p<0.05)的7株突變株進(jìn)行復(fù)篩,即突變株L12、L13、L21、L23、L27、L31、L47。

圖3 脈沖強(qiáng)光誘變突變株的發(fā)酵乳粘度測定

2.3.2 復(fù)篩 脈沖強(qiáng)光對L.bulgaricusIMAU40160誘變的復(fù)篩結(jié)果如表1所示,突變株L27的胞外多糖產(chǎn)量高達(dá)(490.98±12.26) mg/L,較原始株(247.90±13.16) mg/L提高了98.05%,選取突變株L27進(jìn)行后續(xù)實驗。

表1 復(fù)篩結(jié)果

2.4 遺傳穩(wěn)定性的測定

將突變株L27在固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線培養(yǎng)6代,測定突變株每代產(chǎn)糖能力。結(jié)果如圖4所示,突變株L27具有較穩(wěn)定的胞外多糖產(chǎn)糖能力,表現(xiàn)出較好的遺傳穩(wěn)定性。

圖4 突變株L27遺傳穩(wěn)定性的測定

2.5 紅外光譜分析

突變株L27和原始株胞外多糖的紅外光譜圖如圖5所示,兩種多糖樣品都在3283、2937、1654、1408、1133、620和521 cm-1附近出現(xiàn)了吸收峰。吸收峰在3323 cm-1處表明有O-H的振動吸收;2937 cm-1處代表著C-H 的伸縮振動;吸收峰在1654 cm-1和1560 cm-1處對應(yīng)C=O鍵[22]。在1408 cm-1處的吸收峰是羧基或羧酸酯的典型特性吸收峰。1133 cm-1處的強(qiáng)吸收帶,表明多糖中含有吡喃糖環(huán)[23]。620 cm-1和521 cm-1處表明多糖的糖基基團(tuán)之間由糖苷鍵連接。由圖可知,突變株L27胞外多糖的官能團(tuán)相較于原始株沒有明顯差異,因此說明脈沖強(qiáng)光誘變處理不會影響菌株胞外多糖的主要化學(xué)鍵,此結(jié)果與Fang等[24]一致。

圖5 突變株L27和原始株多糖紅外光譜

2.6 掃描電鏡分析

突變株L27和原始株胞外多糖的掃描電鏡圖片如圖6所示,圖6A為原始株胞外多糖的掃描電鏡圖,原始株胞外多糖的微觀結(jié)構(gòu)呈光滑發(fā)亮的蜂窩狀,Ahmed[25]研究發(fā)現(xiàn)這是形成塑化薄膜所需的基本特征。圖6B為突變株L27胞外多糖的表觀結(jié)構(gòu),呈現(xiàn)不規(guī)則多孔緊湊結(jié)構(gòu)。研究表明,這種多孔結(jié)構(gòu)會使多糖具有更高的保水能力,更易溶于水,從而使其快速膨脹,這是作為乳化劑、穩(wěn)定劑和膠凝劑的重要條件[26]。由掃描電鏡結(jié)果可知,脈沖強(qiáng)光誘變處理改變了菌株胞外多糖的表面結(jié)構(gòu),且由微觀結(jié)構(gòu)的對比發(fā)現(xiàn)脈沖強(qiáng)光突變株所產(chǎn)胞外多糖更適合作為天然質(zhì)地調(diào)節(jié)添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)。

圖6 多糖掃描電鏡圖(1000×)

2.7 抗氧化活性的測定

圖7 超氧陰離子自由基清除能力的測定 radical scavenging activity

2.7.2 羥基自由基(·OH)清除能力的測定 羥基自由基(·OH)是一種強(qiáng)效的氧化劑可以與活體細(xì)胞內(nèi)的生物大分子發(fā)生反應(yīng),誘導(dǎo)鄰近大分子發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷[30]。L27和原始株胞外多糖對·OH自由基的清除能力如圖8所示。兩種多糖樣品對·OH自由基的清除能力隨著多糖濃度的增大呈上升趨勢。在多糖濃度在0.2～1.2 mg/mL之間時,L27胞外多糖的·OH清除能力顯著高于原始株(p<0.05)。突變株L27胞外多糖的EC50為0.74 mg/mL,而原始株胞外多糖的·OH自由基清除能力還未達(dá)到EC50。相較于原始株,L27胞外多糖表現(xiàn)出較高的·OH清除能力,這可能是由于突變株L27多糖可以結(jié)合更多由芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的游離羥基,而表現(xiàn)出較高的抗氧化活性[31]。同時,L27胞外多糖的·OH清除能力高于BacillustequilensisFR9[32],具有較好的清除能力。

圖8 羥基自由基(·OH)清除能力的測定

由突變株L27和原始株胞外多糖抗氧化活性的測定結(jié)果可知,脈沖強(qiáng)光誘變在提高菌株胞外多糖產(chǎn)量的同時提高了多糖的抗氧化活性。脈沖強(qiáng)光誘變對菌株多糖抗氧化活性的提高具有更積極的作用。

2.8 SDS-PAGE電泳分析

通過SDS-PAGE凝膠電泳的方法對突變株L27和原始株的菌體蛋白進(jìn)行差異分析,試圖通過觀察菌體蛋白的差異來探究脈沖強(qiáng)光的誘變機(jī)理。實驗結(jié)果如圖9所示。突變株L27和原始株的菌體蛋白都分布在15～225 kDa之間,突變株較原始株出現(xiàn)差異條帶。突變株L27較原始株多出約在83、76、42、17、12 kDa處的條帶,缺失約在65 kDa處的蛋白條帶。這是可能是由于脈沖強(qiáng)光誘變處理后,誘導(dǎo)了原始株的某些蛋白表達(dá),從而可以篩選出胞外多糖高產(chǎn)突變株。

圖9 原始菌和突變株L27的SDS-PAGE分析

3 結(jié)論

本研究對產(chǎn)糖乳酸菌L.bulgaricusIMAU40160進(jìn)行脈沖強(qiáng)光誘變處理,在致死率78.9%、正突變率16.7%的條件下,獲得高產(chǎn)突變株L27,其多糖產(chǎn)量(490.98±12.26) mg/L較原始株提高了98%。沖強(qiáng)光作為一種安全、環(huán)保、操作簡單的處理方式,其應(yīng)用于L.bulgaricusIMAU40160高產(chǎn)胞外多糖的誘變選育,克服了傳統(tǒng)誘變方式(高毒性、操作繁瑣)的弊端,為工程菌株的誘變選育提供了新的思路和技術(shù)手段。本研究首次對誘變前后菌株所產(chǎn)多糖的簡單結(jié)構(gòu)和抗氧化活性進(jìn)行對比分析,發(fā)現(xiàn)脈沖強(qiáng)光處理未對突變株多糖的結(jié)構(gòu)造成不良影響,相反提高了多糖的抗氧化活性。同時,從蛋白水平上對脈沖強(qiáng)光誘變機(jī)理進(jìn)行了初探,發(fā)現(xiàn)脈沖強(qiáng)光引發(fā)了菌株蛋白表達(dá)的差異。綜上,本研究為脈沖強(qiáng)光應(yīng)用于優(yōu)良菌株的誘變選育提供了技術(shù)參數(shù)和理論基礎(chǔ)。

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