冷鮮豬肉中生物膜形成細菌鑒定及成膜變形桿菌清除

朱 晨,李曼寧,王 蕊,劉變芳,宋巧智,夏效東

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

伴隨著生產(chǎn)和貿(mào)易的快速發(fā)展,冷鮮豬肉產(chǎn)品消費量不斷增加。冷鮮豬肉營養(yǎng)豐富、水分含量高,在生產(chǎn)流通過程中極易受微生物污染,其生產(chǎn)過程來自動物腸道、皮毛和環(huán)境中的腐敗菌和致病性細菌極易在不銹鋼、玻璃和塑料等器具設(shè)備表面形成難以清除的細菌生物膜引起產(chǎn)品交叉污染和食源性疾病爆發(fā)[1-4]。細菌生物膜可由一種或者多種微生物形成,水分含量高達97%,穩(wěn)定粘附于物體表面后,細菌開始大量增殖,分泌多種粘附因子,形成致密的生物聚集體[5-6]。相比單個的浮游菌,存在于生物膜中的細菌,由于各種粘附因子的保護,菌體對環(huán)境的適應(yīng)性更強,更不易被清除[7-8]。Bonsaglia等[9]研究了多株李斯特菌在不同材料表面的成膜情況,發(fā)現(xiàn)不銹鋼片表面粘附的菌株明顯多于玻璃片。影響微生物形成生物膜的因素包括微生物自身的性質(zhì)、載體表面性質(zhì)和培養(yǎng)條件等[10-11]。

清洗是提高食品加工設(shè)備衛(wèi)生的重要手段,清洗劑通常是表面活性劑或堿產(chǎn)品,能夠清除接觸表面90%以上的微生物[12]。但是,由于生物膜結(jié)構(gòu)賦予細菌更強的耐受性,因此,很難完全殺死生物膜中的細菌[13]。消毒是通過破壞或溶解胞外聚合物,使抑制劑能夠直接作用于細菌[14]。目前認為游離氯、二氧化氯、臭氧和過氧化氫是合適的消毒劑[15]。柴海榮等[16]發(fā)現(xiàn)堿性清洗劑可以減弱生物膜與器械表面黏附力,相比于含酶清洗劑,其清除效果更好。

本文以冷鮮豬肉淋洗液為培養(yǎng)基質(zhì),探究不同材質(zhì)、溫度及培養(yǎng)時間下的生物膜形成情況,并采用16S rRNA鑒定具有生物膜形成能力的細菌種類,研究NaClO清洗劑和超聲波模擬冷鮮豬肉工業(yè)生產(chǎn)條件下生物膜的清除情況，為預(yù)防和控制冷鮮肉生產(chǎn)過程細菌生物膜污染提供了理論依據(jù)和指導(dǎo),對保證冷鮮肉品質(zhì)及衛(wèi)生安全具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷鮮豬肉 陜西省楊凌示范區(qū)超市當日采集備用;均質(zhì)袋(32 cm×20 cm) 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;304型號不銹鋼片(20 mm×11.5 mm×0.5 mm) 上海市浩程旗艦店;玻璃試管(15 mm×100 mm) 楊凌新三力化玻站;堿性清洗劑 上海雪豹日用化學(xué)有限公司;LB 瓊脂、LB 肉湯、氯化鈉、氯化鉀、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;結(jié)晶紫、冰乙酸、無水乙醇 成都市科龍化工試劑廠;次氯酸鈉溶液(有效氯30 g/L) 朗力生物醫(yī)藥有限公司;2×EsTaqMasterMix、DNA Marker DL 2000 北京康為世紀生物科技有限公司;DuRed核酸染料 北京泛博生物化學(xué)有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

DPX-9082 B-2型恒溫培養(yǎng)箱 上海福瑪實驗設(shè)備有限公司;VORTEX-6型漩渦振蕩儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;Smart SpecTMplus分光光度計、GelDoc 2000型凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司;9600型基因擴增儀 珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司;CD-UPTL II超純水制造系統(tǒng) 成都越純科技有限公司;5804R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預(yù)處理 不銹鋼片和玻璃試管處理:無水乙醇中浸泡30 min,蒸餾水沖洗3遍,70 ℃堿性洗衣粉中浸泡1 h,超聲波清洗15 min,蒸餾水浸泡沖洗3遍,60 ℃烘干,121 ℃下高壓滅菌25 min,60 ℃烘干備用。

冷鮮豬肉濾液制備:冷鮮豬肉絞碎,稱取15 g放入無菌均質(zhì)袋中,加入0.85%無菌生理鹽水285 mL,拍打振蕩10 min,八層無菌紗布過濾,保留濾液。

1.2.2 冷鮮肉中細菌成膜特性研究 肉湯中細菌總數(shù)按照GB4789.2-2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)菌落總數(shù)測定》進行檢測,確定采集樣品細菌總數(shù)未超標[17]。參考Carter等[18]的方法,采用試管內(nèi)置不銹鋼片法培養(yǎng)肉湯中菌群生物膜。試管中加入 2 mL肉湯濾液,放置不銹鋼片,塞上硅膠塞,放置在4、15和26 ℃下靜置培養(yǎng),每個溫度做5個試管重復(fù)。其中4 ℃為通常冷藏溫度，15 ℃為工廠通常作業(yè)溫度，26 ℃為本實驗室室溫。分別培養(yǎng)1、3、6、10、14 d后,取出鋼片,棄濾液,無菌水浸洗試管和鋼片3遍,晾干。鋼片原位放回試管,加入2 mL 0.1% 結(jié)晶紫室溫染色30 min。再次取出鋼片放入干凈離心管,棄染液,無菌水浸洗試管和鋼片3遍,晾干。加入2 mL 33%冰乙酸對試管和不銹鋼片脫色20 min,20 ℃下40 kHz超聲10 min,漩渦振蕩2 min。吸取160 μL脫色液體加入96微孔板中,酶標儀測定OD570值。

1.2.3 成膜細菌分離鑒定 在1.2.2結(jié)果基礎(chǔ)之上，將冷鮮豬肉濾液于26 ℃下靜置培養(yǎng)3 d至混合細菌生物膜成熟后,取出鋼片,棄去肉湯,無菌水浸洗試管和鋼片3遍,晾干。加入 2 mL PBS溶液,20 ℃下40 kHz超聲10 min,漩渦振蕩2 min,至生物膜完全洗脫。10倍系列梯度稀釋后,取2～3個合適稀釋度涂布LB瓊脂平板,37 ℃培養(yǎng)18～24 h。挑選優(yōu)勢典型單菌落特征的單菌落劃線轉(zhuǎn)接新平板進行分離純化。

挑取純化的單菌落加入裝有15 μL無菌水的1.5 mL離心管中,漩渦振蕩混勻,100 ℃煮沸20 min使細胞熱裂解。10000 r/min,4 ℃離心1 min,取上清備用。采用細菌通用引物,上游引物(27F):5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;下游引物(1492R):5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′,擴增產(chǎn)物片段長度約為1 500 bp[19]。25 μL PCR反應(yīng)體系:細菌模板1 μL,12.5 μL 2×Taq Master Mix,上、下游引物各1 μL(10 μmol/μL),9.5 μL無菌ddH2O。PCR擴增程序:94 ℃變性2 min,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,共32個循環(huán),72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物送到生工生物有限公司測序,通過NCBI序列比對鑒定細菌。

1.2.4 細菌生物膜的清除 參考宋金武等[20]和Taj等[21]的方法,用不同濃度次氯酸鈉、超聲波對細菌生物膜進行清除研究。平板活菌計數(shù)和結(jié)晶紫染色測定生物膜清除效果,掃描電子顯微鏡檢測驗證。

菌懸液的制備:冷鮮豬肉中分離到一株的成膜能力強且穩(wěn)定的條件致病性普通變形桿菌(proteusbacillusvulgaris),生物膜清除實驗以此為實驗菌株。挑取單菌落轉(zhuǎn)接于20 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。離心(8000 r/min,4 ℃)5 min,棄上清液,新鮮LB肉湯重懸洗滌2次。調(diào)節(jié)OD600至0.5左右(約108CFU/mL),20倍稀釋后進行生物膜培養(yǎng)(即接種量為5%)。

細菌生物膜的形成及清除:試管中加入2 mL接種量為5%的LB肉湯,放置不銹鋼片(玻片),26 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h。取出鋼片(玻片),無菌水浸洗試管和鋼片(玻片)3遍,晾干。并按照以下清除方法進行,CK:2 mL PBS溶液,浸泡5 min;A:200 mg/L NaClO溶液2 mL,浸泡5 min;B:400 mg/L NaClO溶液2 mL,浸泡5 min;C:600 mg/L NaClO溶液2 mL,浸泡5 min;D:400 mg/L NaClO溶液2 mL,浸泡5 min,100 kHz超聲1 min;E:2 mL PBS溶液,浸泡5 min,100 kHz超聲1 min。每種處理6組平行。

1.2.5 細菌生物膜清除效果檢測 平板活菌計數(shù)法:取出鋼片,無菌水浸洗試管和鋼片3遍,晾干。加入2 mL PBS溶液(pH7.4),20 ℃下40 kHz超聲10 min,漩渦振蕩1 min,至生物膜完全洗脫。10倍系列梯度稀釋后,取2～3個合適稀釋梯度于LB瓊脂培養(yǎng)基上涂布,37 ℃培養(yǎng)24 h后進行平板計數(shù)。每個稀釋度涂布3個平板。

將菌落數(shù)進行換算,即可作為定量生物膜的指標,換算式如(1):

式(1)

式中:A為樣液中菌落數(shù),CFU/mL;B為樣液體積,2 mL;C為生物膜附著的表面積,cm2。

清除效果按照式(2)進行計算:

式(2)

式中:D為對照組細菌總數(shù),CFU/cm2;E為不同清除處理后的細菌總數(shù),CFU/cm2。

結(jié)晶紫染色法:取出鋼片,無菌水浸洗試管和鋼片3遍,晾干。加入2 mL 0.1% 結(jié)晶紫室溫下染色30 min,無菌水浸洗3遍,晾干。33%冰乙酸脫色,冰浴超聲10 min,漩渦振蕩1 min,至生物膜完全溶解。吸取200 μL洗脫液加入96微孔板中,酶標儀測定其OD570值。

掃描電子顯微鏡觀察生物膜:取出玻片,無菌水浸洗3遍,晾干,置于 2.5%戊二醛溶液中,4 ℃下固定10 h,分別用 PBS溶液和無菌水浸洗3次,每次10 min。1% 鋨酸溶液室溫25 ℃下固定5 h,無菌水浸洗3遍,晾干。10%,30%,50%,70%,90%和100%乙醇梯度洗脫玻片各10 min,其中100%乙醇洗脫2次。乙酸異戊酯置換10 min。玻片置于二氧化碳臨界點干燥儀中進行冷凍干燥,用導(dǎo)電銀膠固定在掃描電鏡的樣品臺上噴金鍍膜,達到真空度后,觀察細菌生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鮮豬肉中細菌成膜特性

細菌總數(shù)檢測到肉湯濾液中的細菌總數(shù)為5.39 lg(CFU/mL)。不同溫度下,不銹鋼和玻璃兩種材質(zhì)上冷鮮豬肉中的細菌生物膜形成均呈先升后降趨勢,并隨溫度升高,細菌生物膜的成熟期縮短,且在同溫下兩種材質(zhì)上細菌生物膜形成同時達到頂峰。4、15和26 ℃下,兩種材質(zhì)上的細菌生物膜分別在第10、6和3 d達到峰值。并且,整體不銹鋼材質(zhì)上細菌生物膜量高于玻璃材質(zhì)(見圖1)。

圖1 不同溫度下冷鮮豬肉中菌群在玻璃和不銹鋼表面生物膜形成

2.2 成膜細菌的分離鑒定

洗脫玻璃和不銹鋼片上的細菌生物膜,制備懸液,涂布LB瓊脂培養(yǎng)基進行分離純化。純化菌株采用細菌通用引物進行16S rRNA鑒定。PCR擴增條帶1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。觀察到單一條帶與預(yù)測的條帶片段大小(1500 bp)一致,說明從冷鮮豬肉中分離純化出的1～9號分離菌株提取的DNA片段完整性較好,可以進行測序。

圖2 分離菌株16S rRNA序列擴增結(jié)果

如表1所示,對9株優(yōu)勢菌株的擴增條帶進行測序、比對鑒定,具有生物膜形成能力的9株細菌中有1株假單胞菌,1株成團泛菌,2株普通變形桿菌,5株腐敗希瓦氏菌,其中腐敗希瓦氏菌占55.6%和普通變形桿菌占22.2%，為冷鮮肉中主要成膜污染菌。腐敗希瓦氏菌適合低溫生長,是富含蛋白食品的典型腐敗菌,目前在魚類低溫貯藏過程中多有發(fā)現(xiàn)和研究[22-23]。而普通變形桿菌是條件致病菌,一般存在于被污染或者變質(zhì)的食物中,且具有較強的生物膜形成能力[24]。

表1 成膜菌株16S rRNA序列比對結(jié)果

2.3 細菌生物膜清除效果

平板計數(shù)和結(jié)晶紫檢測均表明,200～600 mg/L NaClO溶液和100 kHz超聲清洗對玻璃及不銹鋼片表面形成的生物膜均有顯著的清除效果(p<0.05)。同一處理對玻璃和不銹鋼兩種材質(zhì)的清除效果無顯著差異(p>0.05)。

200～600 mg/L NaClO溶液對玻璃和不銹鋼表面變形桿菌生物膜的清除率分別可達99%和98%。100 kHz超聲1 min后玻璃和不銹鋼表面的清除率分別是51.02%和71.82%,即不銹鋼表面變形桿菌生物膜清除效果是玻璃表面的1.4倍。400 mg/L NaClO溶液結(jié)合100 kHz超聲聯(lián)合處理后,生物膜細菌清除率略優(yōu)于400 mg/L NaClO溶液單獨清除的效果(見表2和圖3)。NaClO溶液濃度、作用時間以及針對不同的細菌,都會影響生物膜的清除效率。Sarjit等[25]采用40、50 和60 mg/L NaClO溶液對沙門氏菌生物膜作用10 min發(fā)現(xiàn)對沙門氏菌殺菌效果很差。Kim等[26]研究發(fā)現(xiàn)200 mg/L NaClO溶液和1800 mWs/cm2紫外協(xié)同作用可以有效清除工業(yè)廚房和餐廳不銹鋼表面上的李斯特菌生物膜。

表2 不同清除方法對玻璃和不銹鋼表面變形桿菌生物膜清除效果

圖3 結(jié)晶紫染色測定不同材質(zhì)上變形桿菌生物膜的清除結(jié)果

2.4 掃描電鏡檢測玻璃表面生物膜清除效果

由圖4可知,對照組中,桿狀菌體緊密的粘附在玻片表面,相互堆疊,結(jié)構(gòu)緊密,互相連結(jié),顯示了菌株良好的生物膜形成能力。菌體在經(jīng)過不同濃度NaClO溶液清洗后,粘附在玻片上的生物膜大部分都已脫落,僅剩下零星細菌分布在蓋玻片表面,菌體之間極其松散。400 mg/L NaClO溶液結(jié)合100 kHz超聲聯(lián)合處理后僅觀察到少數(shù)單個菌體,變形桿菌生物膜幾乎被完全清除。100 kHz超聲1 min后仍可觀察到大量菌體,且菌體之間相互連接、堆疊,但是生物膜的結(jié)構(gòu)相對松散。

圖4 掃描電鏡觀察玻片上生物膜的清除結(jié)果(5000×)

3 結(jié)論

冷鮮豬肉中污染的微生物極易在玻璃及不銹鋼材質(zhì)表面形成細菌生物膜,其中,在不銹鋼表面形成的生物膜量大于玻璃材質(zhì),并隨著溫度升高,生物膜形成量達到峰值時間提前。從冷鮮豬肉中共分離鑒定到9株主要成膜細菌,包括普通變形桿菌、腐敗希瓦氏菌和假單胞菌等,其中腐敗希瓦氏菌和普通變形桿菌分別占成膜分離菌總數(shù)的55.6%和22.2%。

NaClO溶液和100 kHz超聲波清洗可以有效地清除玻璃和不銹鋼材質(zhì)表面的變形桿菌生物膜,200～600 mg/L的NaClO溶液對玻璃和不銹鋼表面變形桿菌生物膜的清除率分別可達99%和98%以上。100 kHz超聲1 min后不銹鋼表面變形桿菌生物膜清除效果是玻璃表面的1.4倍。400 mg/L NaClO溶液與100 kHz超聲聯(lián)合處理對兩種材質(zhì)表面變形桿菌生物膜清除率略優(yōu)于400 mg/L NaClO溶液單獨清除的效果。

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