荊半夏多倍體新種質(zhì)誘導(dǎo)研究

劉茜，余磊磊，聶倩文 孫正祥，成勝，周燚

(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

半夏[Pinellia.ternata(Thumb) Berit]為天南星科半夏屬多年生草本藥用植物。半夏屬在全球共有9個不同種，主要分布在亞洲東部，其中7個種集中分布于中國四川、湖北、河南、貴州、安徽等省[1]。湖北荊州市作為半夏的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，民國時期陳仁山的《藥物出產(chǎn)辨》曾記載半夏以“產(chǎn)湖北荊州為最”。半夏具有燥濕化痰、降逆止咳和消痞散結(jié)之功效，多以塊莖入藥，其含有許多有用的藥理學(xué)成分，如生物堿、半夏蛋白、甾醇、氨基酸等，其中半夏蛋白具有抗旱孕、抗腫瘤、降血脂、護(hù)肝和治療冠心病等多種重要功能。此外，半夏還是常用的止咳藥材[2,3]。

然而，半夏多以無性繁殖為主，其繁殖率低下，而且隨著近些年人們對野生半夏的大肆采挖，野生資源數(shù)量嚴(yán)重下降。因此，需要推廣家種半夏以滿足人們對半夏的需求。但野生荊半夏生長緩慢，且對軟腐病等細(xì)菌性病害的抗性較低，這嚴(yán)重阻礙荊半夏家種技術(shù)的推廣。多倍體植株利用染色體加倍的劑量效應(yīng)，具有巨大性、低孕性、抗逆性及藥用成分含量增加等優(yōu)點(diǎn)，能快速適應(yīng)家種的環(huán)境。因此，多倍體新種質(zhì)的研究對促進(jìn)半夏種植業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

荊半夏采集于長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗基地；培養(yǎng)基為MS及其改良培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 荊半夏的愈傷組織培養(yǎng)

選取生長健壯的荊半夏球莖，去除其球莖表皮，于自來水下沖洗30min后，在無菌條件下用70%乙醇消毒1min，后用無菌水沖洗3次；0.1%升汞處理5min后，無菌水沖洗4次；然后切除球莖表面，將其切為1cm左右的塊狀物，接種到荊半夏愈傷組織培養(yǎng)基MS+0.5mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA+5mg/L氯霉素上培養(yǎng)[4]。置于25℃暗培養(yǎng)1周后轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)，每天光照12h，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，2周后外植體開始出現(xiàn)綠色的愈傷組織。

1.2.2 多倍體的誘導(dǎo)及純化穩(wěn)定

荊半夏的多倍體通過2個途徑誘導(dǎo)獲得。

1)采用混培法[5]對荊半夏不定芽進(jìn)行多倍體離體誘導(dǎo)。將愈傷組織培養(yǎng)后獲得的綠色愈傷塊用0.01%、0.05%、0.10%、0.20%的秋水仙素分別處理1d、2d、3d、6d，用無菌水清洗3次后，在MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+5g/L檸檬酸的培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。將產(chǎn)生變異的葉片和葉柄切斷后，對變異芽進(jìn)行愈傷培養(yǎng)并用秋水仙素再處理，連續(xù)重復(fù)培養(yǎng)3次后，選擇變異明顯的植株進(jìn)行鑒定。其中，對照植株為無菌水處理。最后，將變異明顯的植株轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2MS+0.2NAA中擴(kuò)大培養(yǎng)并備份多倍體植株[4]。

2)采用覆棉法[6]對生長于盆栽的活體荊半夏芽尖進(jìn)行多倍體的活體誘導(dǎo)。選用直徑一致的荊半夏球莖在室內(nèi)進(jìn)行催芽處理，待其芽尖生長至1cm左右時，將含有濃度為0.01%、0.05%、0.10%、0.20%的秋水仙素的無菌棉球分別覆蓋于荊半夏芽尖上，分別誘導(dǎo)1、2、3、6d，以清水無菌棉球覆蓋處理作為對照。最后統(tǒng)計其成活率和誘導(dǎo)率。

1.2.3 多倍體的鑒定

多倍體變異植株主要是通過外部形態(tài)特征、葉片氣孔特征和根尖染色體數(shù)目3項指標(biāo)進(jìn)行鑒定。

1)植株外部形態(tài)特征比較 觀察經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)處理形成的植株及對照植株，比較兩者生長狀況和形態(tài)發(fā)育的差異，以植株葉片畸形皺縮、植株矮小粗壯、生長緩慢、葉色濃綠作為形態(tài)變異的判別指標(biāo)，統(tǒng)計植株株高、葉片長、葉片寬、葉綠素含量以及誘導(dǎo)率，并應(yīng)用DPS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2)植株葉片氣孔特征比較 通過植株形態(tài)觀察初步判定倍性后，測量葉片葉綠素含量。撕取葉片下表皮制片，然后用體式鏡觀察測量并記錄氣孔長度、寬度及密度3個鑒定指標(biāo)數(shù)據(jù)，并應(yīng)用DPS軟件進(jìn)行顯著性差異分析。

3)根尖染色體計數(shù) 對氣孔顯著增大的變異株，取荊半夏根尖采用壓片制片法制片，然后用顯微鏡觀察并拍照，記錄染色體的數(shù)目，計算其加倍率，以染色體的數(shù)目來判斷其倍性[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體培養(yǎng)條件下秋水仙素的誘導(dǎo)效果

圖1 不同誘導(dǎo)時間和不同濃度秋水仙素下的荊半夏不定芽成活率

圖2 不同誘導(dǎo)時間和不同濃度秋水仙素下的荊半夏不定芽誘導(dǎo)率

荊半夏不定芽通過離體多倍體誘導(dǎo)處理后，不同濃度秋水仙素和不同誘導(dǎo)時間對愈傷組織處理成活率、誘導(dǎo)率之間差異顯著(圖1、圖2)。以處理時間1d為例，用濃度為0.01%秋水仙素處理，荊半夏不定芽的誘導(dǎo)率為0.35%，成活率為82.4%；當(dāng)秋水仙素濃度達(dá)到0.20%時，荊半夏不定芽的誘導(dǎo)率為15.02%，成活率為40.3%。因此，處理時間相同時，隨著秋水仙素溶液濃度的升高，荊半夏不定芽的成活率逐漸降低，且誘導(dǎo)率逐漸升高。此時，秋水仙素的濃度與植株的誘導(dǎo)率呈現(xiàn)出正相關(guān)，且與植株的成活率呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)。再如，用0.05%秋水仙素處理時，當(dāng)誘導(dǎo)時長為1d，荊半夏不定芽的誘導(dǎo)率為1.23%，成活率為78.6%；當(dāng)誘導(dǎo)時間為6d，荊半夏不定芽的誘導(dǎo)率為11.03%，成活率為58.16%。因此，當(dāng)秋水仙素溶液濃度相同時，隨著誘導(dǎo)時間的增加，荊半夏不定芽的成活率逐漸降低，且誘導(dǎo)率逐漸升高。此時，誘導(dǎo)時間與植株的誘導(dǎo)率呈現(xiàn)出正相關(guān)，且與植株的成活率呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)。此外，與0.10%秋水仙素相比，用0.20%秋水仙素處理不定芽的誘導(dǎo)率增加不明顯，而成活率急劇下降(最低為15.3%)。這主要是由于秋水仙素在阻礙紡錘絲形成時，對荊半夏的不定芽產(chǎn)生了一定毒害作用。隨著秋水仙素的濃度和誘導(dǎo)時間的增加，不定芽表現(xiàn)出明顯的生長受阻現(xiàn)象。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)濃度為0.20%時，不定芽在后期培養(yǎng)的成活率進(jìn)一步下降，這說明高濃度秋水仙素處理不利于荊半夏不定芽離體多倍體的誘導(dǎo)。當(dāng)秋水仙素濃度為0.01%～0.10%且誘導(dǎo)時間為3d時，離體誘導(dǎo)的變異苗的不定芽生長健壯，且表型發(fā)生巨大變化(圖3)，相比于對照植株(圖4)表現(xiàn)出葉片肥大、葉柄粗壯等特征。根據(jù)上述分析，認(rèn)為采用混培法對荊半夏進(jìn)行離體多倍體誘導(dǎo)的最佳條件是用0.1%秋水仙素對不定芽進(jìn)行多次重復(fù)處理，每次處理時間為3d，其成活率為48.7%，誘導(dǎo)率可達(dá)28.53%。

圖3 荊半夏離體多倍體變異植株不定芽的比較(左為變異植株，右對照植株)

圖4 荊半夏離體多倍體變異植株根的比較(左為變異植株，右對照植株)

圖5 荊半夏活體多倍體誘導(dǎo)的芽比較(左為變異植株，右為對照植株)

圖6 不同誘導(dǎo)時間和不同濃度秋水仙素下的荊半夏球莖成活率

圖7 不同誘導(dǎo)時間和不同濃度秋水仙素下的荊半夏球莖誘導(dǎo)率響

2.2 荊半夏球莖的多倍體活體誘導(dǎo)

通過觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同誘導(dǎo)時間和不同濃度秋水仙素誘導(dǎo)后，荊半夏芽尖的生長會發(fā)生明顯變化，膨大成盾狀(圖5)，而且生長緩慢。用低濃度的秋水仙素溶液處理包覆有棉球的荊半夏芽尖生長點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)芽尖的誘導(dǎo)率較低、成活率較高(圖6、圖7)。用濃度為0.01%的秋水仙素處理生長點(diǎn)1d，誘導(dǎo)率僅為0.32%，當(dāng)處理時長達(dá)到6d，誘導(dǎo)率增加至9.89%。在4個不同的秋水仙素處理濃度中，在誘導(dǎo)時間相同的情況下，當(dāng)秋水仙素濃度為0.2%時，誘導(dǎo)率均顯著高于其他處理，最高為71.19%。因此，在秋水仙素濃度為0.01%～0.20%時，荊半夏芽尖經(jīng)過處理后，成活率與秋水仙素的濃度、處理時間呈負(fù)相關(guān)，誘導(dǎo)率與秋水仙素的濃度、處理時間呈正相關(guān)。

根據(jù)上述分析，認(rèn)為采用覆棉法進(jìn)行活體多倍體誘導(dǎo)的最佳條件是用0.1%秋水仙素處理荊半夏芽尖6d，誘導(dǎo)率為60.91%，成活率是31.83%。此外，在后續(xù)栽培中觀察檢測發(fā)現(xiàn)，變異植株的50%會發(fā)生回復(fù)突變。

2.3 多倍體的鑒定

2.3.1 植株外部形態(tài)特征比較

與對照植株相比，經(jīng)秋水仙素處理的植株外部形態(tài)特征表現(xiàn)出明顯差異。變異植株表現(xiàn)出生長緩慢、植株矮小、葉色加深、葉片形狀趨于圓形、有的葉片卷曲皺縮甚至畸形等特征。由表1可以看出，變異植株葉片長度與對照植株差異不顯著，但變異植株的株高、葉片寬、柄粗和葉綠素含量與對照植株相比表現(xiàn)出顯著差異。

表1 對照植株與變異植株形態(tài)特征的比較

2.3.2 植株葉片氣孔特征的比較

在體式鏡下觀察對照植株與變異植株葉片氣孔特征發(fā)現(xiàn)，變異植株葉片氣孔長、氣孔寬、氣孔密度與正常植株相比有明顯的差異。由表2可以看到，變異植株的氣孔長度和寬度分別為52.85μm、36.41μm，而對照植株的氣孔長度和寬度分別為38.29μm、26.85μm，變異植株的氣孔長、寬分別是對照植株的1.38倍和1.36倍。在體式鏡下觀察氣孔數(shù)目發(fā)現(xiàn)，對照植株平均每個視野的氣孔數(shù)為11.20個，而變異植株平均每個視野的氣孔數(shù)為7.52個，表明變異植株的氣孔密度變小(圖8)。

表2 對照植株與變異植株葉片氣孔特征比較

圖8 荊半夏植株葉片氣孔特征比較(20×；左為對照植株，右為變異植株)

2.3.3 植株染色體的比較

將對照植株和變異植株進(jìn)行染色體計數(shù)，結(jié)果如圖9所示。對照植株染色體數(shù)目為104條，變異植株染色體數(shù)目為208條，是對照植株的2倍，說明此次多倍體誘導(dǎo)荊半夏的染色體加倍成功。

圖9 染色體觀察結(jié)果(左為變異植株(2n=16x=208)，右為對照植株(2n=8x=104))

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

采用混培法對荊半夏進(jìn)行離體多倍體誘導(dǎo)的最佳條件是0.1%秋水仙素溶液處理3d，成活率為48.7%，誘導(dǎo)率28.53%。采用覆棉法進(jìn)行活體多倍體誘導(dǎo)的最佳條件是0.1%秋水仙素溶液處理6d，誘導(dǎo)率為60.91%，成活率為31.83%。經(jīng)倍性鑒定，獲得了荊半夏多倍體植株(2n=16x=208)，其多倍體植株葉片大而肥厚、葉綠素含量增加，植株緊湊、粗壯，且葉片的氣孔變大、密度減小。

3.2 討論

首先，是多倍體誘導(dǎo)中獲得純合體方法方面。傳統(tǒng)的體細(xì)胞染色體加倍方法采用活體誘導(dǎo)，一般是用一定濃度的化學(xué)誘變劑(如秋水仙素)對頂芽或側(cè)芽、胚、種子等進(jìn)行浸漬、涂抹、注射、滴液等處理[8]。另外，加入二甲基亞砜[9]等助滲劑可提高藥劑的滲透性?；铙w誘導(dǎo)法存在誘導(dǎo)率低、嵌合率高、后代選擇難度大、易受環(huán)境干擾并可能產(chǎn)生回復(fù)突變等缺點(diǎn)[10,11]。與活體誘導(dǎo)法相比，離體誘導(dǎo)法具有容易控制試驗條件和重復(fù)試驗結(jié)果、可通過單細(xì)胞起源的胚狀體途徑克服嵌合體現(xiàn)象[12]等優(yōu)點(diǎn)。本研究基于離體和活體2種誘導(dǎo)途徑，在此基礎(chǔ)上做出相應(yīng)改進(jìn)。將離體誘導(dǎo)的處理方式改進(jìn)為低濃度秋水仙素和培養(yǎng)基混合培養(yǎng)法，這樣可以最大程度上減少秋水仙素對變異植株的傷害，從而提高成活率和誘導(dǎo)率。其次，是嵌合體的純化方面。采用無性途徑誘導(dǎo)多倍體經(jīng)常會出現(xiàn)嵌合體的現(xiàn)象，這需要對獲得的種質(zhì)進(jìn)一步純化。在離體條件下，嵌合體亦可通過切割法[13]及時切除未變異的部分。嵌合體純化費(fèi)時費(fèi)力，大大減慢了多倍體育種速度[14]。本研究采用多次重復(fù)培養(yǎng)進(jìn)行多倍體分離純化，可以獲得純合的多倍體，效果較好。

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