Cd、Pb單一脅迫對(duì)芳樟小苗葉片生理指標(biāo)的影響

謝亞兵 林鈴 畢學(xué)琴 黃秋良 于靜波 張國(guó)防

摘 要：該文以一年生芳樟扦插苗為研究對(duì)象，在溫室大棚采用盆栽的方法研究了不同濃度、不同脅迫時(shí)間下Cd、Pb脅迫對(duì)芳樟生理指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：Cd、Pb脅迫對(duì)芳樟SOD活性、POD活性、MDA含量和可溶性蛋白含量的影響相似。SOD活性、POD活性和可溶性蛋白含量在不同的Cd、Pb濃度脅迫下，在脅迫時(shí)間上均表現(xiàn)為先上升的趨勢(shì)，脅迫45d時(shí)達(dá)到最大值，隨后下降。MDA含量在不同的Cd、Pb濃度脅迫下則是表現(xiàn)出一直上升的趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：芳樟；Cd；Pb；脅迫；生理指標(biāo)

中圖分類(lèi)號(hào) S718.43 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）06-0094-04

Abstract：1a Cinnamomum camphora cutting seedlings by pot culture method greenhouse study on physiological index effects of Cinnamomum camphora indifferent concentrations stress，different time stress of Cd，Pb.The results show that Cinnamomum camphora，Cd and Pb stress on the effects of activities of SOD and POD activity and content and soluble protein content similar to MDA.Activities of SOD and POD activity and soluble protein content indifferent concentrations stress of Cd，Pb firstly show upward trend，the maximum in stress 45d，thendecline.MDA indifferent concentrations stress of Cd、Pb show an upward trend.

Key words：Cinnamomum camphora var.1inaloolifera Fujita.；Cd；Pb；Stress；Physiological index

由于中國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，工業(yè)化和城市化的進(jìn)程不斷加快，隨之而來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題也日漸突出，特別是由“三廢”所導(dǎo)致的重金屬污染開(kāi)始得到社會(huì)廣大群眾的聚焦。Cd、Pb則是眾多重金屬污染物中2種主要的重金屬[1]。這些重金屬污染物通過(guò)人為或者自然的因素污染土壤、水和大氣，而土壤之上所承載的植物自然也會(huì)受到影響[2]。重金屬污染的時(shí)間十分持久，不易被人所察覺(jué)到，而且導(dǎo)致的后果是不可逆的，輕則影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，重則導(dǎo)致植株的死亡[3]。

芳樟（Cinnamomum camphora var.1inaloolifera Fujita.）系樟（Cinnamomum camphora（L.）Presl.）的一個(gè)生化變種，為常綠闊葉喬木，具有生長(zhǎng)迅速、枝葉茂密、樹(shù)干通直等特點(diǎn)，能吸煙滯塵、涵養(yǎng)水源、固土防沙，是我國(guó)南方優(yōu)良的城市綠化、美化樹(shù)種[4]。目前，關(guān)于芳樟重金屬毒害和抗性方面研究較少。鑒于此，本研究對(duì)不同濃度的Cd、Pb單一脅迫下一年生芳樟扦插苗進(jìn)行了試驗(yàn)研究，了解芳樟對(duì)重金屬脅迫下各項(xiàng)生理指標(biāo)的反應(yīng)情況，以期對(duì)芳樟的抗重金屬Cd、Pb脅迫能力的評(píng)定、優(yōu)良抗性基因的篩選以及為重金屬污染地區(qū)環(huán)境綠化、修復(fù)和保護(hù)提供理論依據(jù)[5]。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試材料為福清苗木公司培育的一年生芳樟扦插苗，要求生長(zhǎng)均勻、高度一致，平均苗高15cm、平均地徑0.2cm。在福建農(nóng)林大學(xué)溫室大棚內(nèi)進(jìn)行盆栽，盆體規(guī)格25cm×25cm×30cm，盆下墊托盤(pán)。盆栽基質(zhì)選用沙壤土，土樣風(fēng)干后過(guò)篩并混勻，同時(shí)測(cè)定其基本理化性質(zhì)及重金屬含量背景值（見(jiàn)表1）；每盆裝土約5kg，土壤采用5mg·L-1的福爾馬林消毒。2015年6月20日將苗木全部移栽到盆中，并移入溫室大棚內(nèi)培養(yǎng)。待苗木恢復(fù)生長(zhǎng)后，每盆施入等量500g有機(jī)肥，開(kāi)始進(jìn)行Pb和Cd脅迫處理。Cd、Pb分別以CdCl2·2.5H2O、Pb（NO3）2鹽溶液的形式加入，各設(shè)4個(gè)濃度水平（見(jiàn)表2），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)7株，以清水作為對(duì)照（CK）。自處理后，根據(jù)盆中水分狀況，每隔2～4d等量澆入清水一次，以保證植物正常生長(zhǎng)。然后每隔15d對(duì)葉片進(jìn)行取樣并測(cè)定其生理指標(biāo)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 自樣品處理試驗(yàn)開(kāi)始后，每隔15d每個(gè)處理中每個(gè)重復(fù)隨機(jī)采集7株芳樟幼苗不同部位葉片，每株采集2～3片，將其混合均勻進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 酶液的提取 分別稱(chēng)取各處理芳樟幼苗葉片（去葉脈）0.2g放于預(yù)冷的研缽中，加入1mL預(yù)冷的0.05moL·L-1 pH=7.0的磷酸緩沖液（含1%聚乙烯毗咯烷酮）和少量石英砂，在冰浴上研磨成勻漿，將勻漿轉(zhuǎn)入10mL離心管，再用緩沖液沖洗研缽，全部轉(zhuǎn)入離心管，使最終體積為4mL。于10000r·min-1條件下冷凍離心20min，取上清液于4℃下保存。上清液可用于MDA、可溶性蛋白含量及SOD、POD活性的測(cè)定。

1.2.3 測(cè)定方法 POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；SOD活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定；MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定；可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。這些測(cè)定方法全部參照李合生[6]植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用DPS7.0.5軟件和Excel 2003軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd、Pb單一脅迫對(duì)芳樟SOD含量的影響 由圖1可以看出，單一Cd、Pb脅迫對(duì)芳樟葉SOD活性的影響相似。單一Cd、Pb脅迫下，芳樟葉片中SOD活性自脅迫后15d、30d、45d均隨著處理濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)。在脅迫時(shí)間水平上，脅迫45d時(shí)達(dá)到最高，差異均達(dá)到極顯著水平；在不同濃度水平中Cd80和Pb800處理SOD活性最高。隨脅迫時(shí)間達(dá)到60d時(shí)，SOD活性均明顯下降，脅迫濃度越高，落差越大，下降越快。由此可見(jiàn)，短時(shí)間內(nèi)單一Cd、Pb脅迫會(huì)提高芳樟葉片的SOD活性，但是均在60d的時(shí)候下降到對(duì)照水平及以下。

2.2 Cd、Pb單一脅迫對(duì)芳樟POD含量的影響 由圖2可以看出，單一Cd、Pb脅迫對(duì)芳樟葉POD活性的影響相似。單一Cd、Pb脅迫下，芳樟葉片中POD活性自脅迫后15d、30d、45d均隨著處理濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)，在脅迫45d時(shí)達(dá)到最高，差異均達(dá)到極顯著水平。隨后均呈下降趨勢(shì)，不過(guò)都略高于對(duì)照組。從濃度水平上看，Cd、Pb不同濃度脅迫對(duì)POD活性的影響差異并不是很大。由此可見(jiàn)，短時(shí)間內(nèi)單一Cd、Pb脅迫都會(huì)提升芳樟葉片的POD活性，但是均在60d的時(shí)候開(kāi)始降低，不過(guò)都高于對(duì)照組。

2.3 Cd、Pb單一脅迫對(duì)芳樟MDA含量的影響 由圖3可以看出，單一Cd、Pb脅迫對(duì)芳樟葉MDA含量的影響相似。Cd、Pb單一脅迫下，不同濃度水平下芳樟葉的MDA含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)總體都呈不斷上升的趨勢(shì)，最終在最長(zhǎng)處理時(shí)間達(dá)到最大值；高濃度處理下，15d與60d的差異就會(huì)體現(xiàn)出極顯著水平。即使相同時(shí)間芳樟葉的MDA含量也會(huì)隨著Cd、Pb濃度的增大而上升；其中Cd80、Pb800處理對(duì)MDA含量的影響最顯著。由此可見(jiàn)，長(zhǎng)時(shí)間高濃度的Cd脅迫能夠破壞芳樟葉片細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，Pb脅迫對(duì)細(xì)胞膜同樣具有破壞作用。

2.4 Cd、Pb單一脅迫對(duì)芳樟可溶性蛋白含量的影響 由圖4可以看出，單一Cd、Pb脅迫對(duì)芳樟葉可溶性蛋白含量的影響相似。單一Cd、Pb脅迫下，芳樟葉片中可溶性蛋白含量自脅迫15d、30d、45d后均隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)，在脅迫45d時(shí)出現(xiàn)明顯的提升，差異均達(dá)到極顯著水平，隨后均呈下降趨勢(shì)不過(guò)都高于對(duì)照組。然而從脅迫的濃度上看，在Cd0到Cd60濃度之間和Pb0到Pb400濃度之間兩者均呈上升趨勢(shì)，隨后均呈下降趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，短時(shí)間內(nèi)單一Cd、Pb脅迫會(huì)對(duì)芳樟葉片的可溶性蛋白含量造成影響，但是均在60d的時(shí)候呈下降趨勢(shì)，而且相同脅迫時(shí)間下不同脅迫濃度之間也表現(xiàn)出類(lèi)似的變化。

3 結(jié)論與討論

Cd、Pb對(duì)芳樟SOD活性、POD活性、MDA含量和可溶性蛋白含量的影響呈現(xiàn)出極其高的相似性，均會(huì)對(duì)芳樟產(chǎn)生毒害作用；SOD活性和可溶性蛋白含量在脅迫中的變化幅度要高于POD活性。總體的影響表現(xiàn)為：SOD活性、POD活性和可溶性蛋白含量在不同的脅迫時(shí)間上均表現(xiàn)為先上升的趨勢(shì)，達(dá)到極顯著的變化，脅迫45d時(shí)達(dá)到最大值，隨后下降。MDA含量在不同的Cd、Pb濃度脅迫下則是表現(xiàn)出一直上升的趨勢(shì)。而且從總體上來(lái)看，Cd、Pb脅迫濃度越高，對(duì)于芳樟的傷害越大，且植株本身的保護(hù)系統(tǒng)的水平也會(huì)隨之相應(yīng)的提升。這說(shuō)明芳樟面對(duì)外界的不利環(huán)境條件，本身會(huì)對(duì)此做出反應(yīng)，通過(guò)提升保護(hù)酶的活性以及可溶性蛋白的含量來(lái)抵抗這些不利的環(huán)境因素，體現(xiàn)了芳樟自我保護(hù)機(jī)制。在總的趨勢(shì)上來(lái)看，脅迫時(shí)間超過(guò)45d后，這種能力就會(huì)被削弱。

植物在遭受逆境脅迫下，體內(nèi)的細(xì)胞首先會(huì)受到破壞，從而代謝產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-），原先體內(nèi)的消除平衡被打破，并造成（O2-）的累積，進(jìn)一步對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用[7]。SOD在植物體內(nèi)通過(guò)反應(yīng)消除氧自由基（O2-），以此來(lái)降低該物質(zhì)對(duì)植物細(xì)胞的毒害作用。然而SOD只是降低氧自由基的毒性等級(jí)，之后還需要POD來(lái)消除SOD的反應(yīng)產(chǎn)物（H2O2），并生成無(wú)毒性的H2O[8]。另外一方面，植物體內(nèi)的可溶性蛋白對(duì)于植物的抗逆性也扮演著重要的角色，它對(duì)滲透物質(zhì)起著調(diào)節(jié)作用，維持植物體內(nèi)代謝平衡，其含量是酶類(lèi)參與代謝的一個(gè)重要的指標(biāo)[9-10]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明：芳樟幼苗經(jīng)單一Cd、Pb脅迫后均導(dǎo)致MDA含量增加，并且隨處理濃度的升高、脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增大。這與唐探[11]對(duì)于云南樟Cinnamomum glanduliferum（Wall.）Nees的研究相一致，Cd、Pb脅迫的濃度越大，MDA的含量的越高。說(shuō)明芳樟的細(xì)胞膜遭到破壞，脅迫濃度越大，時(shí)間越長(zhǎng)，這種傷害越嚴(yán)重。相對(duì)應(yīng)的SOD活性、POD活性和可溶性蛋白含量在Cd、Pb單一脅迫下均隨著處理濃度的增加而增加，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)則表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢(shì)。脅迫45d時(shí)，各處理SOD活性均表現(xiàn)出明顯上升的變化趨勢(shì)，脅迫至45d后，各處理SOD活性開(kāi)始下降，這與簡(jiǎn)敏菲[12]在該方面的研究極其類(lèi)似，其對(duì)濕地植物丁香蓼（Ludwigia prostrata）進(jìn)行鉛鎘脅迫發(fā)現(xiàn)丁香蓼SOD活性隨著脅迫濃度的增大表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。王志栓[13]通過(guò)對(duì)人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的研究得出的結(jié)論是人參的POD活性在Cd的單一脅迫下也是先升后降的特征。張家洋[14]對(duì)于蓬萊蕉（Monsteradeliciosa Liebm.）的研究也發(fā)現(xiàn)，Cd、Pb單一脅迫下蓬萊蕉體內(nèi)可溶性蛋白隨重金屬濃度的升高而增加，而在45d后開(kāi)始下降，然而芳樟這三者的下降顯著程度并不相同，SOD活性下降的最為顯著，降到低于對(duì)照水平；POD活性也相對(duì)應(yīng)下降了，不過(guò)并不明顯，仍高于對(duì)照水平；可溶性蛋白含量基本與對(duì)照組持平，不過(guò)也會(huì)因?yàn)槊{迫濃度不同產(chǎn)生一些波動(dòng)。說(shuō)明隨著脅迫濃度的加大和時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致芳樟植物細(xì)胞持續(xù)受損，并導(dǎo)致活性氧自由基在芳樟體內(nèi)過(guò)度積累，短期內(nèi)SOD活性、POD活性和可溶性蛋白均能對(duì)此做出反應(yīng)，但是時(shí)間延長(zhǎng)后，就會(huì)超過(guò)了SOD和POD的清理能力。由于SOD和POD的啟動(dòng)機(jī)制不同，POD活性相比SOD活性會(huì)表現(xiàn)得更為持久一些，可溶性蛋白含量下降可能是芳樟對(duì)外界營(yíng)養(yǎng)元素吸收減弱，開(kāi)始分解體內(nèi)的可溶性蛋白。這說(shuō)明了SOD能對(duì)一定范圍內(nèi)的重金屬脅迫起保護(hù)作用，但是長(zhǎng)時(shí)間的過(guò)氧化作用，最終都使細(xì)胞膜系統(tǒng)受到傷害，甚至死亡[15]。

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（責(zé)編：張宏民）