鼠腸道病毒RT-PCR檢測與基因序列分析

，，

腸道病毒屬(Enterovirus, EV)屬于微小RNA病毒科(Picornaviridae)，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus，PV)、?？虏《?Echovirus，ECHO)、柯薩奇病毒(Coxsackie，CA)、鼻病毒(Rhinovirus, Rhi)、新型腸道病毒[1-3]等。近年來，由腸道病毒屬病毒引的手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎等傳染病在世界各地廣泛散發(fā)或流行，帶來了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，引起了社會和公眾的廣泛關(guān)注[4-5]。

鼠類以儲存宿主或中間宿主的形式傳播各類疾病，是重要的醫(yī)學(xué)媒介生物，已知全球由鼠類傳播的疾病的病原體可以分為病毒、立克次體、螺旋體、細(xì)菌、寄生蟲等5大類[6]。加強以鼠類等醫(yī)學(xué)媒介生物及其攜帶病原體監(jiān)測，已經(jīng)成為口岸和地方衛(wèi)生防疫部門的共識。但是目前尚未見到對鼠類攜帶腸道病毒屬病毒及其傳播風(fēng)險的相關(guān)研究報道。

本研究選取GenBank公布的不同種腸道病毒屬病毒全基因組多聚蛋白(genome polyprotein)氨基酸序列，用CODEHOP(consensus degenerate hybrid oligonucleotide primers)在線軟件設(shè)計一對腸道病毒屬一致-簡并引物，以寧波口岸地區(qū)媒介監(jiān)測捕獲的165只鼠類樣品為模板，提取鼠腸內(nèi)容物RNA進行腸道病毒屬病毒篩查，并對獲得的PCR產(chǎn)物進行測序和遺傳學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1樣品來源 共檢測2016年從寧波港區(qū)捕獲的鼠類樣品165只，其中黑線姬鼠(Apodemusagrarius)80只、黃毛鼠(Rattuslosea)41只、褐家鼠(Rattusnorvegicus)16只、臭鼩(Suncusmurinus)13只、小家鼠(Musmusculus)9只，黃胸鼠(Rattusflavipetcus)6只。

1.2試劑 PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、100 bp DNA Ladder marker、PBS緩沖液、瓊脂糖購自寶生物工程(大連)有限公司；總RNA 小量提取試劑盒(RNeasy mini kit)購自德國Qiagen公司。

1.3 方法

1.3.1病毒RNA提取 無菌條件下取得約50 mg鼠類腸道內(nèi)容物樣品，加入1 mL 1×PBS緩沖液，放入組織研磨儀進行研磨。取200 μL勻漿液，參照Qiagen公司RNA提取試劑盒使用說明書提取病毒RNA，用40 μL無RNA酶的超純水溶解，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2引物合成 依據(jù)GenBank獲得的不同腸道病毒屬病毒代表株的多聚蛋白氨基酸序列，以CODEHOP程序設(shè)計并篩選出一對腸道病毒屬一致-簡并引物E4559/FE4937。依照Kiang D等人文章合成鼻病毒屬通用引物序列DK001/DK004[7]。引物序列見表1。

表1 引物序列
Tab.1 Primers sequence

引物序列目的序列片段大小/bpE4559CAGATCCAGAT?CATTTTGATGG?ATAYRANCARCAEnterovirus2B378FE4937TGTTCTTCTATC?CATAAATTGAATTG?CYTTNCCRCANADK001CAAGCACTTCT?GTTTCCCHRV5′UTR390DK004CACGGACAC?CCAAAGTAGT

1.3.3一步RT-PCR反應(yīng)體系 腸病毒一致-簡并引物擴增采用50 μL反應(yīng)體系： 5× One step RT-PCR Buffer 10 μL; dNTP Mixture (10 mmol/L) 2 μL，Enzyme Mix 2 μL，Ribonuclease Inhibitor 1 μL， 上游引物E4559 (20 μmol)/L 4 μL，下游引物FE4937(20 μmol)/L 2 μL，RNA模板10 μL，RNase Free Water 19 μL。反應(yīng)程序為：60 ℃ 1 min，42 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

鼻病毒通用引物引物擴增采用50 μL反應(yīng)體系： 5× One step RT-PCR Buffer 10 μL; dNTP Mixture (10 mmol/L) 2 μL，Enzyme Mix 2 μL，Ribonuclease Inhibitor 1 μL， 上游引物DK001 (20 μmol)/L 3.75 μL，下游引物DK004(20 μmol)/L 3.75 μL，RNA模板10 μL，RNase Free Water 17.5 μL。反應(yīng)程序為：60 ℃ 1 min，42 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

1.3.4擴增產(chǎn)物序列分析 將擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增結(jié)果，將擴增產(chǎn)物送往上海英俊生物工程公司進行測序，將獲得的基因片段測序與GenBank報道常見腸道病毒流行株進行同源性比較，并利用Mega5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié) 果

2.1腸病毒屬一致-簡并引物RT-PCR檢測 2份從黃毛鼠腸道內(nèi)容物樣品中提取的RNA檢測結(jié)果為陽性，黃毛鼠病毒陽性感染率達到4.9%，其余樣品的反應(yīng)結(jié)果為陰性。擴增產(chǎn)物電泳后可見特異性擴增條帶，片段大小約為378 bp與預(yù)期一致，見圖1。

1：鼠腸道陽性樣品RT-PCR擴增產(chǎn)物；2：陽性對照EV71病毒 RT-PCR擴增產(chǎn)物；M.100 bp DNA Ladder圖1 腸道病毒一致-簡并引物RT-PCR樣品擴增電泳圖Fig.1 Electrophoresis image of samples amplified by RT-PCR using enterovirus CODEHOP primers

2.2測序及遺傳距離分析 2份陽性樣品擴增產(chǎn)物進行基因測序，序列拼接校正后大小與預(yù)期結(jié)果一致，2份陽性樣品基因序列相同，命名為DXEV1601。經(jīng)比較與國內(nèi)外23個不同腸道病毒流行株同源性相似度為50.3%～59.6%，其中與人鼻病毒C NAT001同源性為59.6%相對最為接近，見表2。

表2 DXEV1601與不同腸道病毒流行株部分基因序列的同源性比較
Tab.2 Homology comparison on partial nucleotide sequence of DXEV1601 to the different enterovirus strains

病毒種類毒株與DAEV1601相似度(%)EV71Henan10?0856．0CoxA16FY1856．8CoxA8CVA857．4CoxB2ohio52．3CoxB3MKP50．3EVB84AFP45252．3EVD68EV?D6857．7Polv1NIE111837553．8RVC150?MY?1054．5CoxA12QD?HDH50757．1CoxB4CVB4/P1150．9CoxA41?E9?CA457．1EVE6E6SD11CHN54．4EVE9DM1450．3EV19Burke52．8EV70J670/7155．4PorEV9UKG/410/7352．3PosEVW152．6HRVB3SC222055．8HRV1BSC981358．4HRVCNAT00159．6

2.3種系進化分析 DXEV1601使用腸病毒屬CODEHOP引物擴增片段大小為378 bp，使用Mega5.0軟件對其和其他腸病毒屬病毒進行進化樹分析，結(jié)果見圖2。DXEV1601與人鼻病毒1B SC9813株在一個分支上，并所處鼻病毒分支上。

圖2 腸道病毒部份基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Phylogenic tree of enterovirus partial nucleotide sequences

2.4鼻病毒通用引物RT-PCR檢測 對DXEV1601樣品使用鼻病毒通用引物擴增，擴增產(chǎn)物電泳后可見特異性擴增條帶，片段大小約為349 bp與預(yù)期一致，而對照EV71病毒無特異性條帶，與預(yù)期相符，見圖2。

1：樣品DXEV1601 RT-PCR擴增產(chǎn)物；2：EV71病毒 RT-PCR擴增產(chǎn)物；M：100 bp DNA Ladder圖3 鼻病毒通用引物RT-PCR電泳圖Fig.3 Electrophoresis image of samples amplified by RT-PCR using rhinovirus universal primers

3 討 論

腸道病毒的基因組為7.4 kb的單股正鏈RNA，僅含一個開放讀碼框(open reading frame, ORF)，兩端為保守的非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)。ORF由編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3、VP4的基因和非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D組成，翻譯產(chǎn)物為一個大分子的多聚蛋白[8-9]。本研究采用的一致-簡并引物是依據(jù)隨機GenBank公布的不同種腸道病毒的多聚蛋白氨基酸序列，通過CODEHOP程序設(shè)計，該引物可與GenBank公布腸道病毒流行株目的基因序列匹配，因此理論上本研究所設(shè)計的CODEHOP引物可用于腸道病毒屬內(nèi)各種病毒的檢測。

傳統(tǒng)上根據(jù)病毒在不同動物種類上的感染性、致病性和抗原性差異，將腸道病毒分為脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus, PV 1-3型)、柯薩奇病毒(Coxsackie virus, Cox)A組(CV A1-22和24型)和B組(CV B1-6型)、埃柯病毒(Echovirus, ECV 1-7、9、11-27、29-33)、鼻病毒(Rhinovirus, Rhi)[10]。隨著PCR和基因測序技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前已報道的腸道病毒基因型已超過百種[11]?；谀c道病毒VP1的簡并引物RT-PCR和核苷酸序列分析，已成為腸道病毒基因分型的主要方法[12]。本研究采用了CODEHOP方法設(shè)計腸道病毒屬的一致簡并引物，與常規(guī)簡并引物相比具有簡并度低、退火溫度高、特異性更強等優(yōu)勢[13]。另外，本研究所設(shè)計的引物位于腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)2B區(qū)域，該區(qū)域的檢測和分型未見有國內(nèi)外的研究報道。本研究初步證實了寧波口岸分布中黃毛鼠中存在鼻病毒感染。

從不同腸道病毒流行株基因片段序列同源性比較可知，DXEV1601與其他腸道病毒屬內(nèi)病毒株的同源性相似度相對較低位于50.3%～59.6%，處于不同腸道病毒的同源性相似度(48.9%～90.3%)的范圍之內(nèi)。從腸道病毒部分基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹看，鼠樣品中檢測到的病毒DXEV1601與鼻病毒1B SC9813株位于同一進化分支，遺傳關(guān)系最為接近。同時使用鼻病毒通用引物進行驗證，確證分離到的DXEV1601為鼻病毒。

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