魔芋粉對小鼠急性酒精性胃黏膜損傷和慢性酒精性腸損傷的影響

沈玖君，鄧利玲,2，帥天罡，任 旺，鄧 利,3，鐘 耕,*

酒在中國有著悠久的歷史，已經成為人們日常生活和社交活動中不可缺少的。隨著社會經濟的高速發(fā)展，酒的消耗不斷增加，一次過度或長期大量地飲酒會損害身體健康[1]。有研究表明，長期過度飲酒會造成肝損傷[2]、胃損傷[3]、腸損傷[4]。目前，對酒精性疾病預防的方法主要是戒酒[5]、使用化學合成物[6]、草本植物及天然提取物[7]等。梁桂寧等[8]采用小鼠急性酒精性胃損傷造模，發(fā)現(xiàn)紫菜多糖具有保護酒精性胃損傷的作用；蔡夏夏等[9]研究發(fā)現(xiàn)膳食5′-核苷酸能夠促進慢性酒精性腸損傷的腸道穩(wěn)態(tài)。如今預防酒精性臟器損傷的天然產品具有良好的市場前景[10]。

魔芋粉是優(yōu)良的膳食纖維，在我國魔芋已經被界定為普通食材，魔芋在綠色食品、疾病防治領域都具有良好的應用和開發(fā)[11]。魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）是魔芋粉的主要組成成分[12]，KGM具有減肥[13]、降低血糖[14]、調節(jié)腸道功能[15]、增強免疫功能[16]等多種藥理功能作用。目前已有研究表明KGM在酒精性肝病中起到了較好的預防保護作用，如楊芳等[17]用KGM喂食酒精性脂肪肝大鼠，結果表明KGM通過發(fā)揮其抗氧化應激作用可有效地預防大鼠酒精性脂肪肝；但目前鮮有研究報道魔芋粉對酒精性胃和腸損傷的影響。因此本研究將通過建立急性酒精性胃黏膜損傷和慢性酒精性腸損傷的實驗模型，來探索魔芋粉對酒精性小鼠胃和腸損傷的保護作用及可能的機制，以期為開發(fā)天然的預防酒精性臟器損傷的食品提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

實驗動物為昆明種清潔級小鼠，雄性，體質量（20±2）g，由騰鑫生物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK-（渝）2012-0011，檢疫后備用。小鼠飼料、墊料由騰鑫生物技術有限公司提供。

魔芋粉（KGM質量分數為93%） 重慶康家客食品有限公司；乙醇體積分數56%紅星二鍋頭白酒 北京紅星股份有限公司。

一氧化氮（nitric monoxide，NO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）試劑盒 鄭州唯爾生物科技有限公司；熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑盒、MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit 日本TaKaRa公司；異丁酸、戊酸、正丁酸、乙酸標準品 上海阿拉丁試劑公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

低溫離心機 德國Sigma公司；HIMG酶標儀基因有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱上海齊欣科學儀器有限公司；EG1150H切片機 德國Leica公司；TKY-BMB包埋機 湖北泰康醫(yī)療設備有限公司；H550L高分辨率數碼照相機 日本尼康公司；LightScanner32 Real-Time PCR儀 美國Idaho公司；Rtx-wax毛細管柱 美國RESTEK公司；GC-2010氣相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組、給藥及取材

飼養(yǎng)環(huán)境：動物飼養(yǎng)房溫度保持在22～24 ℃，相對濕度60%～70%，定時通風換氣，自然明暗周期12 h（開燈8：00～20：00）。恒溫恒濕，標準飼料，自由飲水。將100 只昆明種小鼠適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分為魔芋粉低（170 mg/kg mb）、中（240 mg/kg mb）、高（400 mg/kg mb）劑量組及空白組和模型組，每組各10 只。實驗前對各組小鼠進行稱量、標號并記錄。

急性酒精性胃黏膜損傷小鼠造模的方法參照文獻[18]，任選5 組小鼠進行實驗，魔芋粉各劑量組小鼠分別按0.4 mL/20 g mb灌胃魔芋粉溶液7 d，第7天各組給藥后禁食不禁水12 h，于第8天，魔芋粉各組分別按0.2 mL/10 g mb給藥，30 min后，模型組和魔芋粉各組均以14 mL/kg mb灌入乙醇體積分數56%的白酒。1 h后所有小鼠均頸椎脫臼處死，解剖取胃組織置于-80 ℃儲存，用于相關指標的測定。

慢性酒精性腸損傷小鼠的造模方法參照參考文獻[19]，任選5組小鼠進行實驗，魔芋粉各劑量組按0.2 mL/10 g mb灌胃，0.5 h后模型組和魔芋粉組先以0.08 mL/10 g mb連續(xù)灌胃3 d，再以0.10 mL/10 g mb連續(xù)灌胃4 d，再以0.12 mL/10 g mb連續(xù)灌胃5 d，再以0.14 mL/10 g mb灌胃至實驗結束前一天，最后以0.15 mL/10 g mb沖擊性灌胃，空白組和模型組灌胃相同體積的生理鹽水。實驗動物每日灌胃一次，連續(xù)灌胃5 周。小鼠頸椎脫臼處死后，解剖取出腸道，收集盲腸內容物置于-80 ℃保存用于指標測定，并取約1～2 cm腸段用于制備組織切片。

1.3.2 胃黏膜損傷潰瘍指數的測定

把胃平鋪在濾紙上，觀察胃大體潰瘍、糜爛出血點的大小、形狀以及發(fā)生部位，并按Guth等[20]的標準計算潰瘍指數I和潰瘍抑制率A，按潰瘍或糜爛面積大小給予計分。1）點狀出血：出血性糜爛小點或胃黏膜缺損小于1 mm，稱點狀潰瘍，每3 個點狀潰瘍計1 分；2）條狀出血：用游標卡尺測量潰瘍面最大長徑和垂直于最大長徑的最大寬徑，計算兩者的乘積，寬為1 mm者每毫米長為1分；寬為2 mm者每毫米長為2 分；寬為3 mm者每毫米長為3 分；3）點狀和條狀出血計算值之和即為潰瘍指數[21]。按下式計算潰瘍抑制率A。

式中：I1、I2分別為模型組、給藥組的平均潰瘍指數。

1.3.3 胃和腸道組織病理切片觀察

胃和腸道組織病理切片觀察參照文獻[22]。將各組胃、腸組織放入體積分數4%的甲醛溶液固定，用流水沖洗洗去固定液，將組織移入體積分數70%的酒精溶液中保存。將組織依次置于不同濃度的酒精中梯度脫水至組織塊完全脫水透明，并經包埋、切片、染色于數碼顯微鏡下觀察胃和腸道組織的細胞病理改變。

1.3.4 胃組織勻漿中SOD、PGE2活力及MDA、NO含量的測定

胃組織勻漿制備方法參照參考文獻[23]。將胃組織（0.3～0.4 g）稱質量后放入10 mL的小燒杯中。用移液管取質量分數0.86%的冰生理鹽水，總量為所取組織質量的9 倍，用剪刀盡快剪碎組織，剪碎的組織倒入勻漿管中，使用勻漿機將組織充分研碎，整個過程均在冰上進行。將制備好的組織勻漿用離心機以3 000 r/min離心15 min，取上清液，置于4 ℃用于各項指標的測定。

采用酶聯(lián)免疫吸附法測定SOD、PGE2的活力及NO含量；用TBA法測MDA含量。步驟嚴格按照試劑盒說明書。

1.3.5 盲腸內容物游離氨含量的測定

稱取0.3 g盲腸內容物加入10 倍質量的雙蒸水，置于漩渦振蕩儀上渦旋混勻后置于離心機上4 000 r/min離心10 min，靜置，取上清液測定游離氨含量。吸取上述上清液1.0 mL，依次加入配制的Ⅰ溶液（含有0.001 mol/L亞硝基鐵氰化鈉的0.5 mol/L苯酚）1.0 mL和Ⅱ溶液（含有0.03 mol/L次氯酸鈉的0.625 mol/L氫氧化鈉溶液）1.0 mL，混合上述溶液，于60 ℃下反應5 min，再在625 nm波長處測定其吸光度。

1.3.6 盲腸內容物SCFA含量的測定

盲腸內容物中短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）的提取方法參考文獻[24]。準確稱取各實驗組小鼠的盲腸內容物0.2 g，溶于2.0 mL無菌蒸餾水中，置于漩渦振蕩儀上使其成均勻懸浮液靜置10 min，再4 000 r/min離心15 min。吸取上清液1.0 mL置于5 mL離心管中，再加入100 μL體積分數50%的硫酸溶液和1.0 mL無水乙醚，振蕩混勻并密封置于4 ℃冰箱內靜置30 min，移取上層乙醚溶液進行氣相色譜分析。

氣相色譜條件：用Rtx-wax柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）進行實驗，進樣量為1 μL；進樣口溫度200 ℃；進樣方式：分流；柱流量0.91 mL/min，柱箱溫度100 ℃、平衡時間0.5 min；8 ℃/min升溫至180 ℃、保留時間1 min；20 ℃/min升溫至200 ℃、保留時間5 min；檢測器溫度220 ℃；氫氣流量30.0 mL/min，尾吹流量20.0 mL/min，空氣流量300 mL/min。

在氣相色譜條件下進樣測定，5 種SCFA的基本性質見表1；5 種SCFA的標準品色譜圖見圖1。

表1 5 種SCFA基本性質Table 1 Basic properties of 5 SCFAs

圖1 SCFA標準品氣相色譜圖Fig. 1 GC profile of SCFA standards

1.3.7 盲腸內容物微生物菌群的測定

1.3.7.1 細菌基因組DNA的提取

稱取盲腸內容物0.2 g，加入無菌磷酸鹽緩沖溶液3 mL，3 000 r/min離心5 min，提取上清液，12 000 r/min離心3 min，收集沉淀，棄上清液。再按照糞便基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組總DNA，經微量紫外分光光度計測得A260nm/A280nm值在1.8～2.0之間，說明純度較高，可作為熒光定量PCR的模板。

1.3.7.2 熒光定量PCR

盲腸內容物微生物含量測定在定量PCR儀上進行，采用SYBR GreenⅠ染料法，反應體系為20 μL，PCR擴增反應體系如表2所示。反應條件為：95 ℃ 1 min預變性后，雙歧桿菌再進行95 ℃、5 s，56 ℃、15 s，72 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)；乳酸菌、腸桿菌和腸球菌再進行95 ℃、5 s，65 ℃、15 s，72 ℃、30 s，共40 個循環(huán)。循環(huán)結束后就進入溶解，溶解程序為：95 ℃、5 s，65 ℃、15 s，95 ℃、0.1 ℃/s降溫。相關引物見表2。細菌數量的計算參照騫宇[25]的方法，擴增結果用LightScanner 32 Real-Time PCR儀進行分析。反應體系為：10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix、0.8 μL上游引物和下游引物、2 μL DNA模板、6.4 μL雙蒸水。

表2 細菌的PCR擴增引物序列Table 2 Primer sequences used for PCR amplification of bacteria genomic DNA

1.4 數據統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計處理，單因素方差分析法進行顯著性分析，測定結果均以 ±s表示。當P＜0.05時有統(tǒng)計學意義，認為有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 魔芋粉對小鼠胃黏膜潰瘍指數、胃組織抗氧化因子、黏膜保護因子含量的影響

表3 魔芋粉對小鼠組胃黏膜潰瘍指數、胃組織抗氧化因子、黏膜保護因子的影響（n＝8）Table 3 Effect of konjac powder on gastric mucosal ulcer index,antioxidant factors and defensive function (n= 8)

如表3可知，模型組小鼠潰瘍指數與空白組差異較大，模型組小鼠胃黏膜組織中MDA含量顯著升高（P＜0.05），SOD活力顯著降低（P＜0.05），模型組小鼠胃黏膜中NO、PGE2含量顯著低于空白組小鼠（P＜0.05），說明胃黏膜損傷小鼠造模成功。實驗通過魔芋粉干預，與模型組相比，魔芋粉中、高劑量組的胃黏膜潰瘍抑制率分別為25.42%、28.18%。SOD活力、NO和PGE2含量顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。提示魔芋粉對急性酒精性胃黏膜損傷可能有一定的保護作用，且與魔芋粉的劑量有關。

2.2 魔芋粉對小鼠胃黏膜組織病理的影響

圖2 魔芋粉對各實驗組小鼠胃組織病理的影響（×100）Fig. 2 Effect of konjac powder on pathological change of stomach tissue in mice (× 100)

空白組小鼠胃黏膜各層結構清晰完整，未見明顯的出血和炎性細胞浸潤（圖2a）。模型組小鼠胃黏膜損傷嚴重，肌層細胞破裂脫落，各種細胞受損嚴重，局部區(qū)域大量出血壞死，可見大量的炎性細胞浸潤（圖2b）。魔芋粉低劑量組小鼠胃黏膜損傷程度較模型組有所減輕，但黏膜上皮細胞脫落嚴重，有明顯的充血和炎性細胞浸潤現(xiàn)象（圖2c）。魔芋粉中劑量組小鼠胃黏膜損傷程度大大降低，胃組織各層結構較為清晰，黏膜上皮和腺體無明顯損傷，部分表面破損，局部有少量的充血和炎性細胞浸潤（圖2d）。魔芋粉高劑量組小鼠胃黏膜未見明顯損傷，各層結構清晰完整，炎性細胞浸潤不明顯，幾乎接近空白組小鼠（圖2e）。提示魔芋粉能保護小鼠胃黏膜損傷。

2.3 魔芋粉對盲腸內容物SCFA、游離氨、腸道微生物的影響

2.3.1 魔芋粉對盲腸內容物SCFA的影響

如表4所示，與空白組小鼠比較，模型組小鼠盲腸內容物中乙酸、丙酸、正丁酸和戊酸的含量均顯著降低（P＜0.05）。與模型組小鼠比較，魔芋粉中、高劑量組小鼠盲腸內容物中乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、戊酸的含量顯著升高（P＜0.05）。魔芋粉低劑量組小鼠盲腸內容物各酸含量較模型組變化無顯著性意義（P＞0.05）。結果提示魔芋粉能提高酒精性肝損傷小鼠盲腸內容物SCFA的含量，且魔芋粉中、高劑量組效果明顯好于魔芋粉低劑量組。

表4 魔芋粉對盲腸內容物SCFA的影響（n＝8）Table 4 Effect of konjac powder on SCFAs in cecum contents (n = 8)μmol/g

2.3.2 魔芋粉對盲腸內容物游離氨和微生物水平的影響

表5 魔芋粉對盲腸內容物游離氨和微生物水平的影響（n＝8）Table 5 Effect of konjac powder on free ammonia and microorganisms lovels in cecum contents (n= 8)

如表5所示，與空白組小鼠相比，模型組小鼠盲腸內容物中游離氨含量、腸球菌濃度顯著升高（P＜0.05）；乳酸菌和雙歧桿菌的數量顯著降低（P＜0.05），提示長期或大量地飲酒，可使盲腸內容物游離氨含量升高，改變腸道微生態(tài)，益生菌濃度降低，有害菌濃度增加。與模型組小鼠相比，魔芋粉中、高劑量組盲腸內容物游離氨含量、腸球菌濃度顯著降低（P＜0.05），乳酸菌和雙歧桿菌濃度顯著升高（P＜0.05），提示魔芋粉可以改善酒精性腸損傷。

2.4 魔芋粉對小鼠腸道組織病理的影響

如圖3所示，空白組小鼠小腸結構清晰，腸絨毛完整且較長，刷狀緣規(guī)則排列，黏膜層和肌層較厚（圖3a）。與空白組小鼠比較，模型組小鼠小腸絨毛萎縮且不完整，甚至有脫落現(xiàn)象，黏膜層和肌層變薄，固有層出現(xiàn)炎性細胞浸潤，上皮細胞出現(xiàn)潰瘍等（圖3b）。魔芋粉低劑量組小鼠腸絨毛明顯增長但不完整，固有層仍有炎性細胞浸潤（圖3c）。魔芋粉中劑量組小腸有明顯的改善，絨毛刷狀緣排列整齊，且有所增長（圖3d）。而魔芋粉高劑量組小鼠腸絨毛較模型組整齊完整，且明顯增長，與空白組相似（圖3e）。提示魔芋粉能夠改善酒精性小鼠腸道受損的狀態(tài)，且因其劑量不同，改善程度也有所不同。

圖3 魔芋粉對各實驗組小鼠小腸組織病理的影響（×100）Fig. 3 Effect of konjac powder on pathological change of mouse intestinal tissue (× 100)

3 討 論

隨著社會經濟的高速發(fā)展，酒的消耗不斷增加，酒精所引發(fā)的疾病和問題也日益嚴重，急性酒精中毒己經成為節(jié)假日發(fā)病最高的疾病之一。過量飲酒所導致的醉酒，即急性酒精中毒。急性酒精中毒是指一次性攝入過量的酒精或酒類飲料，乙醇在體內的氧化代謝率小于吸收率，使較多的乙醇經過血液循環(huán)進入大腦，引起中樞神經系統(tǒng)產生先興奮后抑制的狀態(tài)，可能出現(xiàn)反應靈敏度下降、嗜睡等現(xiàn)象，嚴重者可導致血壓下降、昏迷、呼吸困難，甚至死亡[26]。在我國解酒產品的種類很多，但長期使用可能會產生毒副作用。隨著人們保健意識的增強，開發(fā)具有解酒功能的天然食品倍受青睞。魔芋粉是一種天然的食材，本實驗研究其對急性酒精性胃黏膜損傷和慢性酒精性腸損傷的作用，為研究開發(fā)天然的預防酒精性疾病的產品提供理論依據。

胃是酒精代謝最先接觸的重要器官，過度飲酒或長期飲酒可引起胃黏膜急性或慢性損傷[27]。在乙醇的刺激下，胃黏膜組織可產生大量氧自由基，并且氧自由基生成量與乙醇呈劑量相關性，氧自由基與膜內多價不飽和脂肪酸結合，形成MDA[28]。MDA是重要的脂質過氧化反應產物之一，可反映機體內脂質過氧化程度，測定其含量常能間接反映細胞損傷的程度。SOD則是對機體氧化與抗氧化系統(tǒng)保持平衡起著重要作用的抗氧化酶之一，具有清除氧自由基并保護細胞免受損傷的功能[29]。NO可以降低胃黏膜中過氧化物酶活性，促進胃黏液分泌起到胃黏膜保護作用[30]。PGE2通過增強胃黏膜的屏障作用，增加黏膜表面黏液分泌和黏膜血流量，清除氧自由基，抑制胃酸等來保護胃黏膜[31]。梁桂寧等[8,32]的研究結果表明，紫菜多糖可通過提高急性酒精灌胃小鼠組織SOD、PGE2，NO、GSH-Px水平從而保護胃黏膜免受損傷。黃進波等[33]研究結果表明竹葉黃酮通過抗氧化、抑制氧自由基產生并升高胃黏膜NO、PEG2含量對小鼠急性胃黏膜損傷起保護作用。Sindhu等[34]研究發(fā)現(xiàn)葉黃素可以降低大鼠潰瘍指數，升高SOD活性可起到保護胃黏膜損傷的作用。本實驗模型組小鼠胃黏膜潰瘍指數、SOD、MDA含量均較空白組明顯升高，在魔芋粉干預后，與模型組相比，魔芋粉中、高劑量組小鼠胃組織NO、PGE2、SOD水平顯著升高，胃黏膜潰瘍抑制率、MDA含量顯著下降。由實驗結果可知，魔芋粉通過升高SOD的活性，增強了清除氧自由基的能力，減少了氧自由基與膜內多價不飽和脂肪酸結合，進而降低了脂質過氧化產物MDA的產生，因而有效地減輕了對胃黏膜結構損傷。此外，經過魔芋粉的干預，小鼠胃黏膜組織NO、PGE2含量明顯升高，有效地降低了胃黏膜中過氧化物酶的活性，增強了胃黏膜的屏障作用，進而起到了保護胃黏膜的作用。

腸道微生物的穩(wěn)態(tài)與人類健康密切相關[35]。腸道中的雙歧桿菌和乳酸桿菌在機體內的有益作用已為人們所共識，它們不但可以調整機體的微生態(tài)平衡，改善消化功能，還可以增強機體的免疫力，延緩衰老。酒精可引起腸黏膜結構完整性的破壞和功能性的障礙，使腸黏膜的通透性增加，導致細菌移位，引起腸道微生態(tài)系統(tǒng)失衡。酒精的攝入會導致腸道紊亂，腸黏膜損傷導致黏膜的屏障功能減弱[36]。益生菌的補充使得革蘭氏陰性菌數量減少，改善酒精引起的腸道菌群變化[37]。游離氨是腸道內主要的腐敗產物，可使腸表皮細胞生理代謝和結構發(fā)生變化，對腸道健康極其不利。有報道指出，SCFA具有保護腸道功能及形態(tài)的作用，還有調節(jié)腸道菌群生態(tài)平衡、改善腸道功能和抗病原微生物等作用[38]。常冰等[39]研究發(fā)現(xiàn)益生菌合劑可以起到保護腸道完整性的作用。本實驗的結果表明，與空白組相比，模型組小鼠盲腸內容物SCFA含量、乳酸菌和雙歧桿菌的濃度顯著降低（P＜0.05）；游離氨含量、腸球菌數量顯著升高（P＜0.05）。經魔芋粉灌胃干預后，與模型組相比，魔芋粉中、高劑量組小鼠盲腸內容物SCFA、乳酸菌和雙歧桿菌濃度顯著升高（P＜0.05）；游離氨含量、腸球菌濃度顯著降低（P＜0.05）。由以上結果可知，魔芋粉使腸道中有益菌濃度增加，有害菌濃度降低，因而SCFA含量顯著升高，游離氨含量顯著降低，進而有效地調節(jié)腸道微生物的平衡，修復結腸屏障的完整性，并對腸道功能及形態(tài)起到了較好的保護作用。

4 結 論

本實驗通過建立急性酒精性胃黏膜損傷模型和慢性酒精性腸損傷模型來探討魔芋粉對酒精性疾病的預防保護作用。通過魔芋粉的干預后，對胃黏膜潰瘍指數，胃組織相關指標，腸道內容物及腸道微生物含量進行測定；結果表明：魔芋粉對小鼠急性酒精性胃黏膜損傷和慢性酒精性腸損傷具有預防保護作用，其可能的機制是魔芋粉通過減少脂質過氧化產物，增強抗氧化作用，清除自由基實現(xiàn)對胃損傷的保護。通過調整腸道微生態(tài)的穩(wěn)態(tài)，增強屏障的保護作用實現(xiàn)對慢性酒精性腸損傷的保護。也為研究開發(fā)天然的預防酒精性臟器損傷的食品提供了理論支撐，且魔芋粉中、高劑量組優(yōu)于魔芋粉低劑量組，綜合經濟因素考慮，可選擇中劑量。

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