乳菇菌素D體外抗腫瘤活性及對細胞周期和凋亡的影響

戎瑞雪，王中傲，李曉嬋，韓躍華，張 奇，李志鵬，郭云然，曹志然*，王 蓓*

惡性腫瘤是嚴重威脅人類生命健康的主要疾病之一，為全球人類死亡的第二大原因[1-2]。據(jù)國家衛(wèi)生和計劃生育委員會最新公布的數(shù)據(jù)，我國每年新發(fā)癌癥病例約310萬，死亡約200萬。近20 年來，我國癌癥發(fā)病率呈逐年上升趨勢，隨著老齡化進程的加快，我國癌癥發(fā)病、死亡率還將不斷上升，對國家、社會和個人造成沉重的經(jīng)濟負擔(dān)[3-5]。目前藥物治療是腫瘤綜合治療的重要治療手段之一。從天然動、植物中提取的天然活性物質(zhì)是抗癌藥物的重要來源之一[6-7]，其中倍半萜類化合物具有抗腫瘤活性，廣泛分布于高等真菌、植物、昆蟲和海洋生物體內(nèi)[8-10]。絨白乳菇（Lactarius vellereus）屬紅菇科（Russulaceae）乳菇屬（Lactarius）[11-12]。絨白乳菇雖有毒，但經(jīng)過浸泡、煮沸后即可食用，具有食藥同源的功效。本課題組從絨白乳菇中分離純化出多種新的蛇麻烷Humulane倍半萜（正在申請專利），前期的初篩實驗發(fā)現(xiàn)其中的一種新型倍半萜（命名為乳菇菌素D）具有較強的抑制腫瘤細胞增殖的作用。本實驗通過體外細胞培養(yǎng)的方法，進一步研究乳菇菌素D對多種不同組織來源的腫瘤細胞的抑制作用；并選取敏感腫瘤細胞株初步研究其抗腫瘤作用機制，為絨白乳菇的食藥同源應(yīng)用與開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A549（人肺腺癌細胞株）、HCT-8（人結(jié)腸癌細胞株）、Bel-7402（人肝癌細胞株）、SMMC7721（人肝癌細胞株）、HeLa（人宮頸癌細胞株）均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細胞資源中心；在-196 ℃液氮中凍存，由本實驗室體外傳代培養(yǎng)。

乳菇菌素D為本課題組從絨白乳菇中提取，純度為98.8%，用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）溶解為10 mg/mL的儲存液，-20 ℃保存?zhèn)溆?；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 美國GIBCO公司；胰蛋白酶（1∶250）北京Solarbio公司；噻唑藍（3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT） 美國Amresco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M4多功能酶標儀 美國Molecular Devices有限公司；8000二氧化碳培養(yǎng)箱 美國賽默飛世爾科技公司；CKX41倒置顯微鏡 日本Olympus公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MTT法檢測乳菇菌素D對幾種人腫瘤細胞增殖抑制作用

常規(guī)復(fù)蘇HeLa、A549、SMMC7721、Bel-7402和HCT-8細胞，調(diào)整細胞濃度為2×104個/mL，90 μL/孔接種于96 孔培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后換為含乳菇菌素D終質(zhì)量濃度分別為100、10、1、0.1、0.01 μg/L的完全培養(yǎng)液；同時設(shè)陽性對照與陰性對照：陽性對照為與乳菇菌素D終質(zhì)量濃度相同的順鉑；陰性對照為分別含有質(zhì)量分數(shù)1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.000 1% DMSO的培養(yǎng)液（與待測樣品中含的DMSO質(zhì)量分數(shù)相同），各質(zhì)量濃度組均設(shè)3 個復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)20、44、68 h后，加MTT（5 mg/mL）15 μL/孔，4 h后棄上清液，加DMSO 150 μL/孔，振蕩5 min，經(jīng)多功能酶標儀490 nm波長處測吸光度，并通過軟件計算藥物的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.2 乳菇菌素D作用A549細胞后倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察

調(diào)整A549細胞濃度為1×105個/mL，以2 mL/皿接種于玻底小皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜，換為終質(zhì)量濃度為10 μg/mL乳菇菌素D的DMEM培養(yǎng)液，陰性對照組加入等體積含質(zhì)量分數(shù)0.1% DMSO的完全培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.3.3 乳菇菌素D作用A549細胞后瑞-姬氏染色光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察

將1×105個/mL的A549細胞接種于預(yù)置蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板中，2 mL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜，換為終質(zhì)量濃度為10 μg/mL乳菇菌素D，并設(shè)陰性對照組（同1.3.2節(jié)）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出蓋玻片，磷酸鹽緩沖液沖洗后，進行瑞-姬氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 流式細胞儀檢測乳菇菌素D處理的A549細胞凋亡率及周期分布

A549細胞以1×105個/mL接種于6 孔板，2 mL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜，換終質(zhì)量濃度分別為100、10、l μg/mL的含乳菇菌素D的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，并設(shè)陰性對照（同1.3.2節(jié)）。收集孔內(nèi)所有細胞，磷酸鹽緩沖液洗2 次。分別取細胞1×106個，每份樣本加入5 μL AnnexinⅤ染液和10 μL碘化丙啶染液，室溫避光染色20 min，經(jīng)流式細胞儀檢測凋亡率。

用上述相同方法處理收集細胞，分別取1×106個細胞，體積分數(shù)70%乙醇溶液1 mL（4 ℃預(yù)冷）固定，4 ℃過夜；1 000 r/min離心5 min除去固定液，磷酸鹽緩沖液洗滌2 次后，100 μg/mL RNA酶100 μL 37 ℃消化30 min；加入50 μg/mL碘化丙啶染色液100 μL，4 ℃避光染色30 min；經(jīng)流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

統(tǒng)計學(xué)方法采用單因素方差分析和t檢驗，所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計均在計算機SPSS 16.0軟件包內(nèi)進行，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳菇菌素D對不同組織來源腫瘤細胞的抑制作用

圖1 乳菇菌素D對腫瘤細胞作用24、48、72 h的IC50Fig. 1 IC50 of mitissimol D against cancer cells at 24, 48 and 72 h

由圖1可知，乳菇菌素D對A549、Bel-7402、SMMC7721和HeLa細胞的體外增殖有顯著的抑制作用，其作用72 h的IC50分別為2.46、19.09、18.21、17.05 μg/mL，均小于20 μg/mL，而對HCT-8抑制作用較弱（IC50為137.26 μg/mL）。

2.2 倒置顯微鏡觀察乳菇菌素D對A549細胞形態(tài)的影響

圖2 乳菇菌素D作用24 h和48 h后A549細胞形態(tài)變化（×1 000）Fig. 2 Morphological observation of A549 cells treated with mitissimol D for 24 and 48 h (× 1 000)

由圖2可知，乳菇菌素D作用后24 h，A549細胞連接開始消失、細胞變圓、脫落，隨著作用時間的延長細胞脫落逐漸明顯，至作用后48 h全部脫落，且細胞皺縮，體積變小，細胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量顆粒。

2.3 瑞-姬氏染色光學(xué)顯微鏡下觀察乳菇菌素D對A549細胞作用后形態(tài)學(xué)變化

圖3 瑞-姬氏染色光學(xué)顯微鏡下乳菇菌素D作用48 h后A549細胞形態(tài)變化（×400）Fig. 3 Morphological changes of A549 cells by Wrights-Giemsa staining after being treated with mitissimol D for 48 h (× 400)

由圖3可知，陰性對照組細胞，染成深藍色或藍紫色（圖中未顯示），色澤均一，胞膜完整；10 μg/mL乳菇菌素D組細胞，胞膜皺縮，染色質(zhì)在核周聚集，細胞核固縮碎裂成數(shù)個圓形顆粒即界限分明的凋亡小體。

2.4 乳菇菌素D對A549細胞凋亡的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度的乳菇菌素D作用于A549細胞72 h的凋亡率Fig. 4 Apoptosis rates of A549 cells treated with mitissimol D at different concentrations for 72 h

圖5 乳菇菌素D作用于A549細胞72 h的凋亡率Fig. 5 Apoptosis rates of A549 treated with mitissimol D at 72 h

如圖4、5所示，1、10、100 μg/mL乳菇菌素D作用于A549細胞72 h后，細胞凋亡率分別為（10.43±2.32）%、（20.22±1.96）%、（32.14±3.04）%，與陰性對照組的（4.98±0.59）%比較，凋亡率升高（P＜0.01）。

2.5 乳菇菌素D對A549細胞周期分布的影響

表1 乳菇菌素D作用72 h對A549細胞周期的影響Table 1 Effect of mitissimol D on cell cycle of A549 cells at 72 h%

圖6 乳菇菌素D對A549細胞周期的影響Fig. 6 Effect of mitissimol D on cell cycle of A549 cells

由表1、圖6可知，與陰性對照組相比，不同質(zhì)量濃度的乳菇菌素D（100、10、1 μg/mL）作用于A549細胞72 h，S期細胞比例明顯增多，G1期細胞比例明顯減少，并且隨乳菇菌素D劑量的增加，乳菇菌素D對A549細胞周期的影響增強。其中10、100 μg/mL劑量組變化明顯，與陰性對照組相比，G1期、S期細胞比例差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果表明乳菇菌素D使A549細胞主要阻滯于S期。

3 討 論

高等真菌又稱為大型真菌，包括蘑菇、香菇、銀耳、金針菇、竹蓀、牛肝菌、靈芝等，許多高等真菌素有“三高”美稱，即蛋白質(zhì)含量高、維生素含量高、纖維素含量高[13]。真菌還有很高的藥用價值，由于其中含有較多的真菌多糖和小分子的萜類物質(zhì)，具有提高免疫力、抑制癌細胞增殖等生物活性[14-15]。真菌多糖的藥物活性被很多學(xué)者關(guān)注研究[16-18]，其中香菇多糖腹腔灌注治療晚期肝癌腹水，效果顯著[19]，此外香菇多糖對小鼠體內(nèi)抗氧化活性有顯著提高作用[20]。繼真菌多糖后，萜類化合物也是重要的抗腫瘤活性成分之一[21-25]。高等真菌中提取物倍半萜的抗腫瘤作用機制，國內(nèi)外學(xué)者有多篇文獻報道，目前其抗腫瘤作用機制的闡述主要有：作用于線粒體導(dǎo)致其功能紊亂、抑制腫瘤細胞血管生成能力、干擾細胞循環(huán)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致癌細胞程序化凋亡、直接作用于腫瘤細胞、擾亂細胞周期誘導(dǎo)細胞程序化死亡、通過對關(guān)鍵酶的磷酸化造成DNA損傷影響細胞增殖等[1,26]。

本實驗經(jīng)MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，從絨白乳菇菌中提取的倍半萜類化合物-乳菇菌素D對不同組織來源的腫瘤細胞均有一定的增殖抑制作用，其中對人肺腺癌細胞株A549抑制作用最強，而對人結(jié)腸癌細胞株HCT-8細胞毒性作用較弱，表明其抗腫瘤作用具有一定的組織選擇性，因此選擇A549作為敏感瘤株進行后續(xù)實驗，研究其抗腫瘤作用機制。

首先，從形態(tài)學(xué)上，參照侯毅鞠等[27]對鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的倍半萜烯類化合物T-2毒素對體外培養(yǎng)急性早幼粒白血病細胞HL60生長抑制作用的研究，本實驗應(yīng)用瑞-姬氏染色法觀察到了乳菇菌素D對A549細胞作用48 h后的凋亡小體。

隨后，從誘導(dǎo)細胞凋亡方面著手，根據(jù)Zheng Yongbiao等[28]對從中國食用菌鮑魚菇中提取的新倍半萜類化合物抑制人前列腺癌細胞的研究結(jié)果，本實驗經(jīng)流式細胞儀檢測了乳菇菌素D作用于A549細胞72 h后的凋亡率為32.14%。乳菇菌素D對A549細胞的IC50為2.46 μg/mL，用100 μg/mL的乳菇菌素D處理后凋亡率只有32.14%，說明該化合物的除了誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡外，可能存在其他抑制細胞增殖的機制，有待進一步深入研究。

再次，本實驗追蹤藥物引起細胞凋亡的原因。王佳麗等[29]從莪術(shù)油中提取倍半萜類化合物作用于肝癌細胞HepG2，使得細胞周期阻滯在G0/G1-S期和S-G2/M期；Imamura等[30]從日本北部的可食用野生植物delphiniifolia中分離提取的沒藥烷型倍半萜過氧化合物，引起G1和G2期細胞阻滯。本實驗通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，乳菇菌素D對A549細胞作用72 h后，多數(shù)細胞阻滯于S期，并且有劑量依賴性。由此可見，乳菇菌素D可通過擾亂細胞周期誘導(dǎo)細胞程序性死亡。

綜上所述，本實驗對絨白乳菇菌中提取的乳菇菌素D的抗腫瘤作用進行研究，發(fā)現(xiàn)了此類倍半萜化合物抗腫瘤活性具有選擇性，對人肺腺癌細胞株A549細胞增殖的抑制作用顯著，可通過干擾細胞增殖周期誘導(dǎo)細胞凋亡。乳菇菌素D作用機制的研究對以乳菇菌素為主要成分的新型抗腫瘤藥物及相關(guān)制劑的研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。

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