超聲對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響及其降解動(dòng)力學(xué)

龔 輝，傅 麗，李瀾奇，陳健樂，劉閃閃，陳士國，葉興乾*

花色苷是一種廣泛分布于自然界的水溶性天然色素，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是2-苯基苯并吡喃陽離子的多羥基或多甲氧基衍生物[1]，屬于多酚類化合物中的黃酮類物質(zhì)[2]。目前已經(jīng)報(bào)道的花色苷有700多種[3]，其中最常見的6 種分別是飛燕草素（delphinidin，Dp）-3-葡萄糖苷（glucoside，glu）、矢車菊素（cyanidin，Cy）-3-葡萄糖苷、天竺葵素（pelargonidin，Pg）-3-葡萄糖苷、錦葵素（malvidin，Mv）-3-葡萄糖苷、芍藥素（peonidin，Pn）-3-葡萄糖苷、矮牽牛素（petunidin，Pt）-3-葡萄糖苷[4]，6 種常見花色苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 6 種常見花色苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structural classification of six common anthocyanidins

天然來源的花色苷具有安全性高、無副作用的優(yōu)點(diǎn)，是優(yōu)良的食品著色劑[5]，隨著消費(fèi)者對(duì)合成色素越來越排斥，花色苷將成為一種具有良好應(yīng)用前景的天然著色劑。同時(shí)，許多研究也表明，花色苷對(duì)人體健康具有一定的促進(jìn)作用，如預(yù)防心血管疾病[6-7]、減肥[8]、抗炎[1]、預(yù)防糖尿病、保護(hù)視力[9]、抗菌、抗腫瘤[10-11]等。因此花色苷的提取分離是花色苷研究的重要內(nèi)容之一。

超聲作為一種簡(jiǎn)單高效、節(jié)約成本的提取手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取研究中，大多數(shù)研究證明，相比于傳統(tǒng)浸提法，超聲輔助提取能夠明顯提高目標(biāo)成分的提取量[12]。然而，超聲過程中由于空化效應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基可能會(huì)與易于氧化的相關(guān)成分發(fā)生反應(yīng)，取決于不同的加工目的和食品基質(zhì)，這種超聲空化作用引起的化學(xué)效應(yīng)可能有害也可能有益[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道，超聲處理能夠引起胡蘿卜素[13]、咖啡酸和芥子酸[14]的降解以及多糖的聚合與裂解[15-16]。而超聲處理對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響也有少量報(bào)道，Tiwari等[17]用超聲處理草莓汁，發(fā)現(xiàn)當(dāng)處理?xiàng)l件達(dá)到最大值時(shí)（振幅100%，20 kHz，10 min，脈沖5 s、間歇5 s）花色苷會(huì)有3.2%的降解。Dubrovic等[18]研究發(fā)現(xiàn)，與未超聲的草莓汁相比，超聲（20 ℃，3、6、9 min）和熱超聲（40 ℃，3、6、9 min和60 ℃，3、6 min）處理后的草莓汁花色苷含量會(huì)下降0.7%～4.4%，而在55 ℃下超聲處理9 min，花色苷含量會(huì)下降5.8%～7.1%。Carrera等[19]在超聲提?。?00 W、24 kHz）紅葡萄花色苷的研究中，發(fā)現(xiàn)超聲處理時(shí)間為6 min時(shí)，花色苷產(chǎn)量達(dá)到最大，超聲提取15 min時(shí)花色苷產(chǎn)量顯著性下降。Mohideen等[20]的研究也發(fā)現(xiàn)，和未超聲的藍(lán)莓汁相比（花色苷質(zhì)量濃度（408.29±21.60） mg/L），當(dāng)超聲振幅從40%增加至80%和100%時(shí)，花色苷質(zhì)量濃度依次下降為（401.61±23.67）、（397.26±18.23）、（393.58±17.45） mg/L。

目前超聲輔助提取花色苷以工藝優(yōu)化研究居多，且大多研究探討超聲對(duì)花色苷提取總量的影響[21-23]，而超聲對(duì)花色苷穩(wěn)定性影響規(guī)律、降解動(dòng)力學(xué)及可能的降解過程卻鮮有報(bào)道。因此，本研究擬采用單因素試驗(yàn)探究超聲提取模擬體系中4 種超聲因素（功率密度、溫度、溶劑、pH值）對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響規(guī)律，同時(shí)根據(jù)經(jīng)典化學(xué)反應(yīng)模型，采用試錯(cuò)法分析花色苷在超聲場(chǎng)下的降解動(dòng)力學(xué)，包括反應(yīng)級(jí)數(shù)、半衰期、反應(yīng)速率常數(shù)等。并結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)超聲處理后的花色苷降解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，以期為超聲輔助提取花色苷的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 種花色苷標(biāo)準(zhǔn)品：飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷（純度均大于95%） 美國Sigma公司；甲醇、乙腈、甲酸（色譜級(jí)） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；純凈水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；鹽酸（優(yōu)級(jí)純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)（配有可變波長紫外檢測(cè)器和Empower色譜工作站） 美國Waters公司；1100液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源和Mass Hunter Qualitative Analysis B.07工作站） 美國Agilent公司；PHS-550 pH計(jì) 杭州陸恒生物科技有限公司；MS105DU電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；浴式超聲波裝置 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲條件對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響

1.3.1.1 花色苷超聲處理

準(zhǔn)確稱取飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷各1.00 mg，溶解到pH 2的70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇溶液中。用25 mL容量瓶配制40 μg/mL的混合物母液，取5 mL母液加35 mL 70%甲醇配制成5 μg/mL的稀釋液。取2 mL 5 μg/mL的稀釋液加入超聲管，密封后進(jìn)行超聲處理，每個(gè)梯度做3 個(gè)平行。采用單因素試驗(yàn)研究超聲功率密度（27、81、135、189、243 W/L）、溫度（10、25、40、55、70 ℃）、溶劑（100%甲醇、70%甲醇、100%乙醇、70%乙醇、水）、pH值（1、2、3、4、5）4 種因素對(duì)常見的5 種花色苷的穩(wěn)定性影響規(guī)律。單因素試驗(yàn)設(shè)置的前提條件如下：溶劑為70%甲醇；溫度10 ℃；時(shí)間10 min；pH 2；功率密度為135 W/L。超聲處理的功率密度、溶劑、溫度、pH值按照單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行，超聲處理后的樣品過0.22 μ m有機(jī)濾膜后存放在-20 ℃冰箱用于HPLC檢測(cè)。

1.3.1.2 花色苷HPLC測(cè)定

參照Tiwari等[24]的方法并加以改進(jìn)，對(duì)5 種花色苷進(jìn)行定量。液相條件：Agilent ZORBAX SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A相為5%甲酸溶液，B相為100%甲醇。洗脫程序?yàn)椋?～25 min：15%～35% B；25～30 min：35%～15% B。檢測(cè)波長520 nm，流速為1 mL/min，柱溫設(shè)置30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。外標(biāo)法繪制5 種花色苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在1.00～9.00 μg/mL范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度與峰面積具有良好的線性相關(guān)（R2≥0.996）。

1.3.2 花色苷超聲降解動(dòng)力學(xué)模型構(gòu)建

釆用試錯(cuò)法構(gòu)建10 ℃下pH 2的70%甲醇中，功率密度135 W/L時(shí)5 種花色苷在超聲波處理0～70 min內(nèi)的降解動(dòng)力學(xué)模型。該方法具體原理如下：假設(shè)級(jí)數(shù)為零、一、二、三級(jí)，則反應(yīng)物質(zhì)量濃度ρ與時(shí)間t、反應(yīng)物質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)ln ρ與時(shí)間t、反應(yīng)物質(zhì)量濃度的倒數(shù)1/ρ與時(shí)間t、反應(yīng)物質(zhì)量濃度的倒數(shù)平方1/ρ2與時(shí)間t呈線性關(guān)系，相應(yīng)線性回歸系數(shù)最高的模型可以確定為花色苷超聲降解動(dòng)力學(xué)模型。零、一、二、三級(jí)動(dòng)力學(xué)模型如式（1）～（4）所示。

式中：ρ為反應(yīng)物質(zhì)量濃度/（μg/mL）；ρ0為反應(yīng)物初始質(zhì)量濃度/（μg/mL）；k為反應(yīng)速率常數(shù)/（μg/（mL·min））；t為反應(yīng)時(shí)間/min。

1.3.3 花色苷超聲降解產(chǎn)物液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

參考Sadilova等[25]的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，液相條件：色譜柱Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A相為0.5%甲酸溶液，B相為100%乙腈。洗脫程序?yàn)椋?～5 min：100% A，5～20 min：100%～90% A，20～40 min：90%～87% A，40～44 min：87%～80% A，44～50 min：80%～75% A，50～55 min：75%～100% A。檢測(cè)波長280 nm，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正負(fù)離子同時(shí)掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 000；干燥氣流速5 L/min；干燥氣溫度325 ℃；霧化器壓力310 kPa；鞘氣溫度為350 ℃；鞘氣流速11 L/min；陽離子模式毛細(xì)管電壓為3 000 V，陰離子模式毛細(xì)管電壓為3 500 V。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Origin 2016軟件繪制圖表，SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及差異顯著性分析（鄧肯氏多項(xiàng)式比較），P＜0.05表示差異顯著。同時(shí)采用Chemical Draw 15.0軟件繪制超聲降解過程圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲條件對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響

2.1.1 超聲功率密度對(duì)花色苷穩(wěn)定性影響

圖2 超聲功率密度對(duì)5 種花色苷穩(wěn)定性的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic power intensity on the stability of five anthocyanins under ultrasound treatment conditions

超聲功率密度在0～243 W/L范圍內(nèi)對(duì)5 種花色苷穩(wěn)定性的影響如圖2所示。結(jié)果表明：超聲功率密度在0～81 W/L范圍內(nèi)時(shí)，隨著超聲功率密度增加，5 種花色苷質(zhì)量濃度逐漸下降，且下降趨勢(shì)明顯（P＜0.05）。這是因?yàn)樵诔暪β拭芏认鄬?duì)較低的范圍內(nèi)時(shí)，空化泡較容易形成，并且隨著超聲功率密度的增加，空化泡破裂時(shí)釋放的能量更強(qiáng)[26]。同時(shí)由于空化作用產(chǎn)生高溫、高壓，促使水分子裂解為自由基，而自由基由于含有未配對(duì)電子，性質(zhì)非?；顫姡哂袕?qiáng)氧化性，也會(huì)導(dǎo)致花色苷的降解[27]。隨著超聲功率密度的繼續(xù)增加（81～243 W/L），5 種花色苷的質(zhì)量濃度除飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷外，變化不再明顯，僅有微弱的減少。這可能是由于當(dāng)超聲功率密度增大時(shí)，過大的功率密度導(dǎo)致空化泡來不及破裂，以至過多的氣泡對(duì)超聲波的傳播有所阻礙，所以繼續(xù)增大超聲功率密度不再帶來更大的降解作用。而飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷質(zhì)量濃度隨著超聲密度的增加仍然呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，可能與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。它們的B環(huán)結(jié)構(gòu)中都含有鄰二酚羥基，羥基越多，花色苷越不穩(wěn)定，相反，甲基化卻能夠增加花色苷的穩(wěn)定性[28]。因此，含有甲氧基的錦葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷相對(duì)更加穩(wěn)定。Cheynier等[29]的研究也發(fā)現(xiàn)，含有鄰二酚羥基的花色苷比沒有鄰二酚羥基的花色苷降解率大，而沒有鄰二酚羥基的花色苷對(duì)氧化敏感性也相對(duì)較低。

2.1.2 超聲溫度對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響

圖3 超聲溫度對(duì)5 種花色苷穩(wěn)定性的影響Fig. 3 Effect of temperature on the stability of five anthocyanins under ultrasound treatment

超聲溫度在10～70 ℃變化范圍內(nèi)對(duì)5 種花色苷穩(wěn)定性的影響如圖3所示，5 種花色苷在超聲處理?xiàng)l件下的降解率隨著溫度升高而下降，在10 ℃超聲處理下5 種花色苷質(zhì)量濃度分別是相應(yīng)對(duì)照組的19%、74%、81%、81%和80%；而在70 ℃時(shí)5 種花色苷的質(zhì)量濃度卻達(dá)到對(duì)照組的90%～96%。這一規(guī)律與本課題組先前對(duì)β-胡蘿卜素和常見7 種酚酸的研究結(jié)果類似[13-14]，這可能與溫度對(duì)溶劑物理性質(zhì)的影響有關(guān)，升高溫度會(huì)使液體黏度和表面張力降低，同時(shí)飽和蒸氣壓的上升使更多溶劑蒸汽進(jìn)入空化泡腔內(nèi)，從而導(dǎo)致空化泡破裂時(shí)的劇烈程度減弱，進(jìn)而導(dǎo)致超聲空化效應(yīng)的下降[30]。而體積分?jǐn)?shù)70%甲醇的飽和蒸汽壓隨著溫度的升高而增大，因此空化強(qiáng)度隨著溫度的升高而下降，即導(dǎo)致了花色苷在低溫下超聲降解率高，高溫下降解率低的結(jié)果。

從對(duì)照組可以看出，5 種花色苷質(zhì)量濃度隨溫度增加，在55、70 ℃都呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），表明花色苷的熱穩(wěn)定性較差。Dubrovic等[18]報(bào)道，與對(duì)照組相比，用85 ℃、2 min巴氏殺菌法處理的草莓汁花色苷含量減少了5.3%～5.8%。Shaheer等[31]報(bào)道，和未處理樣品相比，80 ℃、5 min巴氏殺菌法處理后的閻浮樹果汁花色苷含量下降了34%。Brownmiller等[32]也報(bào)道了與鮮果中花色苷相比，95 ℃漂燙3 min會(huì)使藍(lán)莓中總花色苷含量損失43%。結(jié)合溫度對(duì)超聲空化效應(yīng)的影響及其對(duì)花色苷的影響，可以得出花色苷的提取適宜在40 ℃下進(jìn)行。

2.1.3 超聲溶劑對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響

圖4 溶劑對(duì)超聲處理下5 種花色苷穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Effect of solvents on the stability of five anthocyanins under ultrasound treatment

花色苷的提取通常在溫和條件下進(jìn)行，提取溶劑多是酸性的水和極性有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇等）組成的混合物。因此本研究選用5 種常見的花色苷提取溶劑研究花色苷在不同超聲溶劑下的穩(wěn)定性。從圖4可以看出，與對(duì)照組相比，在不同溶劑超聲處理下的花色苷質(zhì)量濃度都有顯著性下降（P＜0.05），但是在不同溶劑中下降程度有所不同。5 種花色苷質(zhì)量濃度在100%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇、100%乙醇和70%乙醇溶液中下降相對(duì)較少，其中在70%乙醇溶液中下降最少，而在70%甲醇溶液和水中下降較多（P＜0.05）。這一結(jié)果表明，不同溶劑類型對(duì)超聲空化效應(yīng)也有一定的影響。Ashokkumar等[33]研究也發(fā)現(xiàn)向提取介質(zhì)中加入乙醇能夠減少提取過程中羥自由基的產(chǎn)生。在降解最多的70%甲醇溶液中，飛燕草素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖的降解率分別為38%和26%，高于天竺葵素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷（降解率分別為20%、23%、22%），表明花色苷在超聲場(chǎng)中的穩(wěn)定性也和自身的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。如前所述，這可能與飛燕草素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖的B環(huán)結(jié)構(gòu)中都含有鄰二酚羥基有關(guān)。

Wang Wenjie等[23]研究發(fā)現(xiàn)櫻桃（Prunus avium L.）和紅梨皮（Pyrus communis L.）的超聲輔助提取最優(yōu)條件分別是80%乙醇、30 ℃、20 min和60%乙醇、30 ℃、60 min。Dranca等[34]研究發(fā)現(xiàn)茄子皮（Solanum melongena L.）超聲輔助提取的最優(yōu)條件是54.4%甲醇、37 kHz、55.1 ℃、44.85 min。Boulekbache-Makhlouf等[35]也報(bào)道70%甲醇是最合適的茄子皮（S. melongena L.）花色苷提取的溶劑。表明從花色苷提取總量的角度考慮，甲醇或乙醇與水的混合物都有可能是最好的提取溶劑，但是從花色苷穩(wěn)定性以及溶劑毒性的角度來看，70%乙醇是更合適的提取溶劑。

2.1.4 超聲pH值對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響

圖5 pH值對(duì)超聲處理下5 種花色苷穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effect of pH on the stability of five anthocyanins under ultrasound treatment

從圖5可以看出，與對(duì)照組相比，在不同pH值下超聲處理后的花色苷質(zhì)量濃度都有顯著性下降（P＜0.05）。在pH 1～5范圍內(nèi)，5 種花色苷降解率呈先增后減的趨勢(shì)，在pH 3時(shí)下降值達(dá)到最大。這一結(jié)果可能與花色苷在不同pH值下具有不同的結(jié)構(gòu)形式有關(guān)。Araceli等[36]報(bào)道了花色苷在不同pH值下具有不同存在形式（圖6）：pH 1時(shí)，花色苷以紅色的黃烊鹽離子為主要存在形式（圖6A）；pH 2～4之間，醌式堿是主要存在形式（圖6B～D）；當(dāng)pH值處于5～6時(shí)，花色苷有2 種存在形式，分別是無色的甲醇假堿（圖6E）和查耳酮（圖6F）。從結(jié)構(gòu)上可以看出，pH 2～4時(shí)的主要存在形式醌式堿具有碳氧雙鍵，由于碳氧雙鍵屬于不飽和鍵，易發(fā)生氧化，因此在超聲場(chǎng)中產(chǎn)生的自由基和活性氧的誘導(dǎo)下發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致花色苷在pH 3時(shí)降解較多（P＜0.05）。另外，從圖5中還可以看出，5 種花色苷在pH 1～2時(shí)降解最少，因此花色苷的提取適宜在低pH值下進(jìn)行。

圖6 花色苷在不同pH值下的存在形式Fig. 6 Chemical forms of anthocyanins under various pH conditions

2.2 花色苷超聲降解動(dòng)力學(xué)模型

圖7 5 種花色苷超聲降解動(dòng)力學(xué)分析Fig. 7 Kinetic analysis of five anthocyanins under ultrasonic treatment

5 種花色苷在10 ℃、pH 2、70%甲醇、功率密度135 W/L時(shí)，0～70 min內(nèi)超聲處理下的降解動(dòng)力學(xué)模型如圖7所示。根據(jù)試錯(cuò)法計(jì)算出花色苷的質(zhì)量濃度變量ρ、ln ρ、1/ρ、1/ρ2與時(shí)間t的相關(guān)系數(shù)R（表1），依據(jù)相應(yīng)線性回歸系數(shù)最高的模型為花色苷超聲降解動(dòng)力學(xué)模型可以得出：飛燕草素-3-葡萄糖苷超聲降解動(dòng)力學(xué)模型為一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，而矢車菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷超聲降解動(dòng)力學(xué)模型為零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。對(duì)花色苷超聲降解過程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模型分析可用于預(yù)測(cè)超聲提取或加工過程中花色苷的降解速度，從而可以控制花色苷的損失，提高花色苷的保留。由于諸多因素都會(huì)對(duì)花色苷穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，因此許多學(xué)者都針對(duì)不同因素對(duì)花色苷的降解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了模擬，發(fā)現(xiàn)在不同的條件下，花色苷符合的降解動(dòng)力學(xué)模型也不盡相同，主要可分為零級(jí)、一級(jí)、二級(jí)和復(fù)雜反應(yīng)動(dòng)力學(xué)[27]。而花色苷在超聲場(chǎng)下的降解動(dòng)力學(xué)還只有少量報(bào)道，Tiwari等[37]對(duì)超聲處理草莓汁中花色苷和抗壞血酸在貯藏期間穩(wěn)定性的研究中發(fā)現(xiàn)，天竺葵素-3-葡萄糖苷超聲降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。Sun Jianxia等[38]研究發(fā)現(xiàn)天竺葵素-3-葡萄糖苷在低溫超聲場(chǎng)下降解也是一級(jí)動(dòng)力學(xué)。Yao Guanglong等[39]在超聲功率對(duì)藍(lán)莓中矢車菊素-3-葡萄糖苷影響的研究中發(fā)現(xiàn)其超聲場(chǎng)下的降解同樣為一級(jí)動(dòng)力學(xué)。而本研究中除飛燕草素-3-葡萄糖苷超聲降解動(dòng)力學(xué)模型為一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型外，其他4 種花色苷（矢車菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷）的超聲降解動(dòng)力學(xué)模型均為零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。這可能與超聲處理的頻率、振幅、功率密度、花色苷的質(zhì)量濃度以及所處的介質(zhì)有關(guān)。在相應(yīng)的模型條件下對(duì)不同花色苷降解動(dòng)力學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)k、半衰期t1/2和回歸系數(shù)R2進(jìn)行回歸分析（表2）。

表1 5 種花色苷降解動(dòng)力學(xué)擬合方程的線性回歸系數(shù)Table 1 Fitting degradation equations of five anthocyanins with correlation coefficients

表2 5 種花色苷超聲降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Degradation kinetic parameters of five anthocyanins under ultrasound treatment

2.3 花色苷超聲降解產(chǎn)物鑒定

圖8 5 種花色苷10 ℃下超聲處理1 h前后液相色譜圖Fig. 8 HPLC chromatogram of five anthocyanins before and after ultrasound treatment for 1 hour at 10 ℃

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)花色苷主要降解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，由液相色譜圖（圖8）可以看出花色苷在超聲處理后出現(xiàn)新的色譜峰，其相應(yīng)的質(zhì)譜信息如表3所示。天竺葵素-3-葡萄糖苷降解產(chǎn)物質(zhì)譜信息中峰1和峰2的出峰時(shí)間十分接近，為20.201、21.117 min，且[M-H]?相同，均為m/z 343，根據(jù)Lopes等[40]的報(bào)道可判斷為anthocyanone A1和anthocyanone A2（二者互為同分異構(gòu)體），即8-β-D-吡喃葡萄糖基-2,4-二羥基-6-氧代環(huán)己基-2,4-二烯基乙酸（anthocyanone A）。峰3負(fù)離子模式下[M-H]?m/z 285，正離子模式下[M+H]+m/z 287，所以峰3的分子質(zhì)量為286 Da，推測(cè)峰3為山柰酚。峰4 [M+H]+m/z 130，可推測(cè)其分子質(zhì)量為129 Da。峰5從色譜圖上對(duì)比可知為天竺葵素-3-葡萄糖苷。峰6在質(zhì)譜中響應(yīng)太低，需要進(jìn)一步鑒定。峰7 [M-H]?m/z 465，[M+Cl]?m/z 501，[M+Na]+m/z 489，所以可推測(cè)峰7分子質(zhì)量為466 Da。錦葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷的峰1和峰2出峰時(shí)間及[M-H]?都和天竺葵素-3-葡萄糖苷峰1和峰2的信息幾乎完全相同，因此可同樣判斷為anthocyanone A1和anthocyanone A2。錦葵素-3-葡萄糖苷的峰3 [M-H]?m/z 355，可推測(cè)其分子質(zhì)量為356 Da。峰4質(zhì)譜響應(yīng)太低，需要進(jìn)一步鑒定。峰5 [M+H]+m/z 199，推測(cè)其為丁香酸。峰6負(fù)離子模式下[M-H]?m/z 153，正離子模式下[M+H]+m/z 155，所以峰6分子質(zhì)量為154 Da，推斷為2,6-二甲氧基苯酚。峰7從色譜圖上對(duì)比可知為錦葵素-3-葡萄糖苷。芍藥素-3-葡萄糖苷分離到的降解產(chǎn)物相對(duì)較少，峰3在質(zhì)譜里響應(yīng)太低，需要進(jìn)一步鑒定；峰4從色譜圖上對(duì)比可知為芍藥素-3-葡萄糖苷。飛燕草素-3-葡萄糖苷分離到的降解產(chǎn)物也相對(duì)較少，峰1 [M-H]?m/z 479、[M+Cl]?m/z 515，可推測(cè)其分子質(zhì)量為480 Da，可能的分子式為C21H20O13。峰2[M+H]+m/z 195，推測(cè)其為阿魏酸。從色譜圖上對(duì)比可知峰3為飛燕草素-3-葡萄糖苷。矢車菊素-3-葡萄糖苷分離到的降解產(chǎn)物相對(duì)較多，峰3 [M-H]?m/z 367，可以推測(cè)其分子質(zhì)量為368 Da。峰5 [M-H]?m/z 479、[M+Cl]?m/z 501，可以推測(cè)其分子質(zhì)量為480 Da，可能的分子式為C21H20O13。峰6從色譜圖上對(duì)比可知為矢車菊素-3-葡萄糖苷。峰10 [M-H]?m/z 301，可推測(cè)其分子質(zhì)量為302 Da，為槲皮素。峰4、7～9、11質(zhì)譜響應(yīng)太低，需要進(jìn)一步鑒定。

表3 5 種花色苷超聲降解產(chǎn)物質(zhì)譜信息Table 3 Assignments of new chromatographic peaks of five anthocyanins obtained by HPLC-MS after ultrasound treatment

2.4 花色苷超聲降解過程推測(cè)

對(duì)于天竺葵素-3-葡萄糖苷的降解產(chǎn)物山柰酚，其可能的降解過程如圖9A所示，天竺葵素-3-葡萄糖苷首先進(jìn)行脫糖反應(yīng)生成天竺葵素，然后水分子進(jìn)攻C環(huán)中的4位碳原子產(chǎn)生羥基，并進(jìn)一步被氧化生成山柰酚。通過對(duì)比底物和最終產(chǎn)物之間的結(jié)構(gòu)，可以推測(cè)矢車菊素-3-葡萄糖苷超聲降解形成槲皮素（圖9B）與天竺葵素-3-葡萄糖苷降解成山柰酚過程的機(jī)制相同。對(duì)于飛燕草素-3-葡萄糖苷中降解成阿魏酸，其過程可能為低pH值下部分由飛燕草素-3-葡萄糖苷轉(zhuǎn)化而來的甲醇假堿在超聲作用下B環(huán)和C環(huán)間發(fā)生斷裂，并進(jìn)一步生成中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為阿魏酸，而其具體的降解過程及在4 種花色苷（天竺葵素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷）降解產(chǎn)物中都檢測(cè)到的anthocyanone A、在錦葵素-3-葡萄糖苷的降解產(chǎn)物中檢測(cè)到的丁香酸、2,6-二甲氧基苯酚的降解過程仍需要進(jìn)一步的研究和探索。

圖9 降解途徑Fig. 9 Hypothetical schemes for the formation of degradation products

3 結(jié) 論

在0～81 W/L范圍內(nèi)，隨著超聲功率密度的增加，5 種花色苷質(zhì)量濃度逐漸下降，繼續(xù)增加超聲功率密度（81～243 W/L），5 種花色苷質(zhì)量濃度除飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷外，變化不再明顯，僅有微弱減少，表明花色苷穩(wěn)定性和其結(jié)構(gòu)有關(guān)；隨著溫度升高，花色苷在超聲處理下的降解率反而下降，即超聲空化效應(yīng)與溫度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)；5 種花色苷在70%乙醇溶液中降解最少，因此花色苷的提取劑以70%乙醇溶液為宜；pH 1～5范圍內(nèi)，花色苷降解率呈先增后減趨勢(shì)。動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明飛燕草素-3-葡萄糖苷超聲降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，矢車菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷超聲降解符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。在天竺葵素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷4 種花色苷降解產(chǎn)物中都檢測(cè)到anthocyanone A，同時(shí)也檢測(cè)到山柰酚、槲皮素、丁香酸、阿魏酸、2,6-二甲氧基苯酚等。對(duì)其降解過程推測(cè)，發(fā)現(xiàn)花色苷超聲降解和熱降解及微波降解過程有所不同。而關(guān)于花色苷在其他超聲條件下的降解動(dòng)力學(xué)以及更為詳盡的降解過程仍需進(jìn)一步研究。

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