熱處理對大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)和凝膠性的影響

陶汝青，夏 寧*，滕建文

熱處理使蛋白質(zhì)亞基發(fā)生解離、疏水基團暴露，有利于大豆蛋白凝膠的形成。而熱處理強度的差異是大豆蛋白凝膠發(fā)生差異的主要原因。Kato等[1]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)加熱處理溫度越高、時間越長，蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)就被破壞得越嚴重。熱處理會破壞蛋白質(zhì)的雙螺旋結(jié)構(gòu)，80 ℃以上的溫度對大豆蛋白進行熱處理會引起二級結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的變化，且蛋白質(zhì)的剛性結(jié)構(gòu)會被解離[2]。在大豆蛋白熱制凝膠過程中大豆蛋白的β-折疊含量會降低，而無規(guī)卷曲的含量會提高[3]。熱變性程度對蛋白質(zhì)的二硫鍵、疏水相互作用的影響不同，這會直接影響到以大豆蛋白凝膠特性為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)豆腐類產(chǎn)品的凝膠特性。周淑紅等[4]在豆腐制備過程中加入二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），發(fā)現(xiàn)隨著DTT濃度的增加，豆腐的凝膠強度降低，說明巰基的氧化和二硫鍵的形成對其凝膠強度具有一定的影響。段文達等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在大豆蛋白凝膠制作的過程中加入十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），隨著SDS添加量的增加，大豆蛋白形成凝膠的時間會縮短，這說明肽鏈充分展開，疏水基團暴露，有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。包中宇[6]研究發(fā)現(xiàn)，隨著超聲處理時間的延長，大豆蛋白凝膠樣品巰基含量增加，這說明超聲處理使巰基暴露到蛋白質(zhì)表面，在凝膠形成過程中二硫鍵更容易形成，所以凝膠樣品游離巰基含量降低。

由于傳統(tǒng)豆腐類產(chǎn)品的凝膠成型過程中，均需要一定的溫度條件使其中的大豆蛋白變性，進而形成不同凝膠強度的豆類制品；因此為了進一步闡述大豆蛋白凝膠中蛋白的變性程度對其凝膠強度的影響，本研究將對不同熱處理溫度和時間下大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）的亞基組成、二級結(jié)構(gòu)、自由氨基、游離巰基、表面疏水性進行測定，以期明確SPI的熱變性程度與其凝膠性的關(guān)系，為通過控制蛋白的變性程度來控制凝膠類豆制品的加工特性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI采用堿溶酸沉法[7]自制。

葡萄糖酸-γ-內(nèi)酯（gluconic acid lactone，GDL）市售；三羥甲基氨基甲烷（tris aminomethane，Tris）、丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、四甲基乙二胺（tetramethyl ethylene diamine，TEMED）、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺 北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司；鄰苯二甲醛（orthophthalaldehyde，OPA）、亮氨酸（99%）、溴化鉀、二硫硝基苯（5,5′-dithio-2-nitrobenzoate，DTNB）美國Sigma-Aldrich公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉山東玉嶺化工有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalesulfonic，ANS） 上海譜振生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DC-1500真空冷凍干燥機 上海達程實驗設(shè)備有限公司；UV-1601PC紫外分光光度計、ST16R冷凍離心機賽默飛世爾科技（中國）有限公司；RF-5301PC熒光分光光度計 日本島津公司；Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）儀美國熱電公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；TA.XT plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；TGL-16G高速臺式離心機 上海醫(yī)用分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

不同熱處理溫度下的SPI樣品：將質(zhì)量分數(shù)9%的SPI溶液分別置于70、75、80、85、90、95 ℃條件下水浴加熱10 min，取出一部分熱處理后的SPI溶液，冷卻，用于測定亞基組成、自由氨基濃度、游離巰基含量、表面疏水性及二級結(jié)構(gòu)（將熱處理后的SPI溶液凍干成粉末），以未進行熱處理的SPI樣品作對照；另一部分加熱溫度為70、80、90、95 ℃的SPI溶液中添加0.33 g/100 mL的GDL，80 ℃條件下保溫30 min，冷卻后測定蛋白的凝膠強度及失水率，同時做空白實驗（對照組，不加熱）。

不同熱處理時間下的SPI樣品：將質(zhì)量分數(shù)9%的SPI溶液置于90 ℃條件下分別水浴加熱5、10、20、30、40、50、60 min，取出一部分熱處理后的SPI溶液，冷卻，用于測定亞基組成、自由氨基濃度、游離巰基含量及表面疏水性；另一部分加熱時間為5、10、15、20 min的SPI溶液中添加0.33 g/100 mL的GDL，80 ℃條件下保溫30 min，冷卻后測定蛋白的凝膠強度及失水率。

熱處理后SPI在不同保溫溫度與時間下的樣品：將質(zhì)量分數(shù)9%的SPI溶液分別置于90 ℃下水浴加熱10 min，然后添加0.33 g/100 mL的GDL，分別在70、80、90 ℃條件下保溫20、30、40、50、60 min，冷卻后測定蛋白的凝膠強度及失水率。

1.3.2 熱處理后SPI的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)測定

1.3.2.1 自由氨基濃度的測定

采用OPA法[8]測定自由氨基濃度。取加熱處理后的5 mg/mL SPI溶液200 μL與4 mL OPA混合，于35 ℃條件下反應(yīng)2 min，用紫外分光光度計在340 nm波長處測定吸光度A340nm。以L-亮氨酸為標準物繪制標曲，算出SPI中自由氨基的濃度。

1.3.2.2 游離巰基含量的測定

參考Beveridge等[9]的實驗方法。取加熱處理后的0.1 mg/mL SPI溶液2 mL，加入80 μL Ellman試劑（4 mg/mL DTNB），立即混勻，靜置5 min后，在412 nm波長處測吸光度（A412nm），再計算游離巰基含量，公式如式（1）所示。

式中：13 600為摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm））；ρ為蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.2.3 表面疏水性的測定

表面疏水性的測定參考文獻[10]。取4 mL加熱處理后的0.1～0.5 mg/mL SPI溶液與20 μL ANS溶液混合，設(shè)定激發(fā)波長為365 nm，發(fā)射波長為520 nm，狹縫校正均為5 nm，用熒光分光光度計測定混合液的熒光強度。表面疏水性用熒光強度-蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度曲線的斜率表示。

1.3.3 SDS-PAGE測定

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）不連續(xù)緩沖系統(tǒng)進行還原電泳和非還原電泳，分離膠體積分數(shù)為7.5%，濃縮膠體積分數(shù)為4%，制備還原電泳樣品緩沖液時添加β-巰基乙醇，樣品緩沖液上樣量為10 μL，V（甲醇）∶V（冰醋酸）∶V（純水）＝100∶100∶800的脫色液脫色。

1.3.4 FTIR的測定

將處理后的SPI樣品采用溴化鉀壓片，用FTIR儀進行掃描。掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)8次。掃描后的圖譜用Omnic軟件校正后，再用PeakFit v4.12軟件對酰胺Ⅰ帶1 600～1 700 cm-1波段的圖譜進行分析，根據(jù)峰面積計算各二級結(jié)構(gòu)組分的比例。

1.3.5 熱處理后SPI的功能特性測定

1.3.5.1 凝膠強度的測定

凝膠強度的測定參考文獻[11]，將SPI凝膠冷卻成型后，切成1 cm×1 cm×1 cm的均勻小塊，置于物性測試儀上測定其凝膠強度。SPI凝膠強度為當用儀器測定時使SPI破碎的最大力，單位是g。質(zhì)構(gòu)參數(shù)：探頭型號P/0.5，測前速率1.0 mm/s，測試速率2.0 mm/s，測后速率1.0 mm/s，測定距離8.0 mm。

1.3.5.2 凝膠失水率的測定

凝膠失水率的測定參考文獻[12]，將SPI凝膠切成0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm的小粒，稱取5～10 g的SPI凝膠裝入10 mL離心管中，以4 000 r/min離心30 min，然后小心倒出離心管內(nèi)被離心析出的水，并用濾紙將殘留在離心管壁的水吸干凈，最后稱質(zhì)量。失水率的計算如式（2）所示。

式中：m1為離心前凝膠質(zhì)量/g；m2為離心后凝膠質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗重復(fù)3 次，取平均值，用Origin 8.6和SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計和方差分析（ANOVA），用Duncan法進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理溫度和時間對SPI自由氨基濃度的影響

圖1 熱處理溫度（A）和時間（B）對SPI自由氨基濃度的影響Fig. 1 Effect of heat treatment temperature (A) and time (B) on free amino group content of SPI

對蛋白質(zhì)進行熱處理，在熱處理過程中蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)會被分解，導(dǎo)致自由氨基濃度變化，通過自由氨基濃度的測定可以反映蛋白質(zhì)的變性情況。圖1A為熱處理溫度對SPI自由氨基濃度的影響，未進行熱處理時SPI中自由氨基濃度為0.02 mmol/L，隨著熱處理溫度的升高，SPI中自由氨基濃度增加；當熱處理溫度為95 ℃時自由氨基濃度為1.28 mmol/L，自由氨基濃度的提高反映了SPI分子鏈的斷裂或降解，這說明隨著熱處理溫度的升高，蛋白質(zhì)分解加劇。

圖1B為熱處理時間對SPI自由氨基濃度的影響，在90 ℃下熱處理5 min時自由氨基的濃度為0.26 mmol/L，隨著熱處理時間的延長，SPI中自由氨基的濃度先迅速增加之后變化不明顯，熱處理60 min時自由氨基濃度為0.65 mmo/L；這說明SPI受熱分解主要發(fā)生在加熱過程的開始階段。郭鳳仙[13]研究也發(fā)現(xiàn)隨著熱處理溫度的升高，SPI中自由氨基濃度迅速增加，熱處理的前期自由氨基濃度升高比較顯著，隨后上升緩慢。這可能是因為受熱初期，SPI熱變性程度增加，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生展開或蛋白發(fā)生解離，所以自由氨基濃度有所提高；隨著熱處理時間的延長，SPI可能發(fā)生了氧化而變性，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，最終產(chǎn)生不溶性沉淀，所以自由氨基濃度上升比較緩慢[14-15]。

2.2 熱處理溫度和時間對SPI游離巰基含量的影響

圖2 熱處理溫度（A）和時間（B）對SPI游離巰基含量的影響Fig. 2 Effect of heat treatment temperature (A) and time (B) on free thiol content of SPI

圖2 A為熱處理溫度對SPI游離巰基含量的影響。未進行熱處理時游離巰基的含量為19.85 μmol/g，熱處理從70 ℃升高到80 ℃，游離巰基含量雖然增加但并不顯著（P＞0.05）；當熱處理溫度提高到85 ℃以上時，游離巰基含量增加顯著（P＜0.05），并在95 ℃時達到最大，為85.29 μmol/g。這可能與大豆球蛋白（glycinin，11S）和β-伴大豆球蛋白（β-con-glycinin，7S）的熱變性有關(guān)。一般情況下7S熱變性的溫度范圍是68～82 ℃，11S熱變性的溫度是83～95 ℃[16-18]，由于溫度低于80 ℃時主要引起7S變性，而7S中游離巰基含量比較少，所以游離巰基含量增加不明顯，且在相對較低的熱處理溫度下，蛋白質(zhì)亞基之間相互接觸比較少，這樣的條件容易導(dǎo)致聚集體的形成；所以70～80 ℃溫度范圍內(nèi)，巰基含量上升較慢[15]。馬丹等[19]研究發(fā)現(xiàn)，隨著熱處理溫度的升高，SPI中巰基暴露加劇，游離巰基含量不斷增加。

圖2B為熱處理時間對SPI中自由巰基含量的影響。熱處理從5 min延長到10 min時，自由巰基含量從31.99 μmol/g增加到70.22 μmol/g，之后隨著熱處理時間的延長自由巰基的含量不斷下降，這可能與生成的可溶性聚集物有關(guān)；隨著熱處理時間的延長，11S中解離的游離巰基進一步生成新的二硫鍵，同時游離的巰基也可能會發(fā)生氧化，最終導(dǎo)致游離巰基的含量減少。李理特等[20]在95 ℃條件下對不同處理時間豆?jié){的游離巰基含量進行測定，發(fā)現(xiàn)隨著豆?jié){熱處理時間的延長，游離巰基含量先增加后降低，熱處理時間為10 min時游離巰基含量達到最大值。Hashizume等[21]研究也發(fā)現(xiàn)在豆?jié){加熱過程中巰基會發(fā)生氧化，最終影響豆腐凝膠強度。

2.3 熱處理溫度和時間對SPI表面疏水性的影響

圖3 熱處理溫度（A）和時間（B）對SPI表面疏水性的影響Fig. 3 Effect of heat treatment temperature (A) and time (B) on surface hydrophobicity of SPI

圖3 A為熱處理溫度對SPI表面疏水性的影響。未進行熱處理的SPI的表面疏水性為39.01，隨著熱處理溫度的升高，SPI的表面疏水性大幅度提高，熱處理溫度為95 ℃時，表面疏水性達到最高，為569.86。這可能是因為隨著熱處理溫度的升高，SPI熱變性加劇，分子鏈展開，暴露出更多的疏水基團，從而引起表面疏水性增加。王中江等[22]研究發(fā)現(xiàn)，熱處理溫度提高會導(dǎo)致大豆蛋白表面疏水性增加。Matsudomi等[23]研究了熱處理溫度對豆?jié){表面疏水性的影響，發(fā)現(xiàn)當熱處理溫度升高時，豆?jié){中大豆蛋白的表面疏水性也會升高。

圖3B為熱處理時間對SPI中表面疏水性的影響。熱處理5 min時SPI的表面疏水性為274.91，熱處理從5 min延長至10 min時，SPI的表面疏水性顯著增加（P＜0.05），并且在10 min時達到最大，為404.09，之后隨著熱處理時間的延長，蛋白質(zhì)的表面疏水性降低，當熱處理60 min時，表面疏水性僅為215.56。這可能是因為隨著熱處理時間的延長，蛋白質(zhì)間相互作用加強，蛋白質(zhì)的表面疏水性增加，當表面疏水相互作用達到一定程度時，蛋白質(zhì)的亞基會聚集形成共價鍵及氫鍵等結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水相互作用降低。李理特等[20]研究熱處理時間對豆?jié){中表面疏水性的影響發(fā)現(xiàn)，95 ℃熱處理10 min的豆?jié){中大豆蛋白的熒光強度最強，之后隨著時間的延長，豆?jié){的熒光強度明顯降低。

2.4 熱處理溫度和時間對SPI亞基的影響

大豆蛋白主要由11S和7S組成，11S主要成分為酸性亞基和堿性亞基，酸性亞基分子質(zhì)量約為35 kDa，堿性亞基分子質(zhì)量約為18 kDa；7S主要成分是α、α′、β 3 種亞基，分子質(zhì)量分別約為65、62、57 kDa[24]。

圖4 不同熱處理溫度（A）和時間（B）后SPI的SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE analysis of SPI at different heat treatment temperatures (A) and times (B)

由圖4A可知，當熱處理溫度提高時，進樣槽口殘留的聚集體就會增多，而且分離膠中每一條條帶的顏色也逐漸加深，這可能是因為隨著熱處理溫度的升高，SPI熱變性程度加劇，引起SPI分子亞基的解離，解離后SPI的分子質(zhì)量變小，最終蛋白質(zhì)分子形成聚集體，這與Feng等[25]研究結(jié)果相似。從圖4A還原圖譜中可看出，分離膠頂層條帶變淺，這說明生成的大分子聚集體中可能含有二硫鍵[26]。

由圖4B可知，在非還原狀態(tài)下，隨著熱處理時間的延長，電泳槽口中聚集體不斷增多，這是因為大分子質(zhì)量聚集體形成。無論是還原圖譜還是非還原圖譜都可以看出，隨著加熱時間的延長，條帶中11S的B亞基顏色變淺，這可能是因為11S由于熱變性而發(fā)生解離，最終導(dǎo)致11S中B亞基生成不溶性沉淀[27]。

2.5 熱處理溫度對SPI二級結(jié)構(gòu)的影響

表1 熱處理溫度對SPI二級結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effect of heat treatment temperature on secondary structure of SPI

由表1可看出，不經(jīng)過任何熱處理的SPI的二級結(jié)構(gòu)中β-折疊含量最高，Pleitz[28]和Marcone[29]等研究發(fā)現(xiàn)SPI二級結(jié)構(gòu)以β-折疊為主。隨著熱處理溫度的升高，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中各組分含量的變化比較復(fù)雜，其中β-折疊的含量降低，α-螺旋的含量有所提高，無規(guī)卷曲的含量增加。王中江等[22]研究發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)過任何熱處理的SPI相比，經(jīng)過熱處理后SPI的α-螺旋含量會增加，β-折疊含量會降低。李楊等[30]通過分析熱處理SPI的紅外光譜發(fā)現(xiàn)，相比于未進行任何熱處理的蛋白質(zhì)樣品，熱處理使SPI中的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，而β-折疊結(jié)構(gòu)含量降低。在研究熱處理對其他蛋白的影響時也發(fā)現(xiàn)，熱處理會導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的β-折疊含量的下降[31]。

2.6 熱處理溫度和時間對SPI凝膠性的影響

圖5 熱處理溫度（A）和時間（B）對SPI凝膠性質(zhì)的影響Fig. 5 Effect of heat treatment temperature (A) and time (B) on gel property of SPI

圖5 為熱處理溫度和時間對SPI凝膠性的影響。熱處理溫度從70 ℃提高到90 ℃時，凝膠強度從33.38 g提高到80.85 g，95 ℃時凝膠強度為74.51 g；這可能是由于溫度高于90 ℃后SPI的熱變性更嚴重，對凝膠強度的影響不利。隨著溫度的升高，失水率降低，這可能是因為蛋白質(zhì)分子受熱變性后，溫度的升高導(dǎo)致蛋白質(zhì)的活性基團不斷暴露，蛋白質(zhì)分子之間相互結(jié)合，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越來緊密，所以失水率降低。熱處理從5 min提高到20 min，SPI的凝膠強度從26.49 g提高到60.35 g，失水率也明顯下降，15 min之后，隨著熱處理時間的延長，形成凝膠的強度雖有增加但幅度不大。這可能是因為在熱處理初期，隨著加熱時間的延長蛋白質(zhì)分子之間相互作用增加，之后隨著加熱時間的延長，維持蛋白質(zhì)凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)基本達到最大，所以凝膠強度的變化不大。張海瑞等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在90 ℃條件下，隨著熱處理時間的延長，SPI形成凝膠的凝膠強度呈上升趨勢。

2.7 保溫溫度和時間對SPI凝膠性的影響

SPI凝膠制備過程中，保溫凝固的溫度與時間也是SPI形成凝膠的關(guān)鍵因素。圖6為凝膠保溫溫度和時間對SPI凝膠性質(zhì)的影響。在相同保溫時間條件下，隨著保溫凝膠溫度的升高，SPI凝膠強度增加、失水率降低。在相同的保溫溫度條件下，隨著保溫時間的延長，形成凝膠的強度增加，失水率有所降低。在30 min之前，隨保溫時間的延長，凝膠強度增加比較明顯，30 min之后凝膠強度雖有上升但幅度不大，這可能是因為當凝膠保溫達到一定時間時，保溫時間對凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響趨于飽和，所以形成凝膠的強度、失水率變化不明顯。綜合考慮選擇90 ℃條件下保溫30 min來制備凝膠比較合適。

圖6 保溫溫度和時間對SPI凝膠強度（A）和失水率（B）的影響Fig. 6 Effect of temperature and holding time on gel strength (A) and water loss rate (B) of SPI gel

3 結(jié) 論

以SPI為原料，研究熱處理溫度和時間對SPI自由氨基濃度、游離巰基含量、凝膠強度及失水率等的影響，并對熱處理后的SPI在熱致凝膠過程中的保溫溫度與時間對其凝膠性質(zhì)的影響進行分析，以期為以大豆蛋白為主要凝膠機制原料的大豆產(chǎn)品的制備提供理論依據(jù)和工藝的參考。熱處理加劇SPI亞基的解離與聚集，并導(dǎo)致SPI二級結(jié)構(gòu)中β-折疊含量明顯下降，α-螺旋含量有所提高，無規(guī)卷曲含量明顯增加。隨著熱處理溫度從70 ℃提高到95 ℃，SPI中自由氨基濃度、游離巰基含量以及表面疏水性分別從0.02 mmol/L、19.85 μmol/g及39.01提高到1.28 mmol/L、85.29 μmol/g與569.86，此過程中制成SPI凝膠的強度先增加后降低，凝膠失水率逐漸減??；隨著熱處理時間從5 min延長到60 min，自由氨基濃度呈先顯著上升后趨于平緩的趨勢，游離巰基含量及表面疏水性則先顯著上升后呈現(xiàn)降低趨勢，此過程中制成SPI凝膠的強度先顯著提高后趨于平緩；因此一定范圍內(nèi)自由氨基濃度、自由巰基含量及表面疏水性的提高有利于SPI凝膠的形成。當保溫溫度升高或時間延長時，SPI形成凝膠的強度呈逐漸上升趨勢，同樣凝膠的失水率仍呈下降趨勢。綜上考慮，制備SPI凝膠的最佳條件為：熱處理90 ℃、15 min，并在后續(xù)的熱致凝膠過程中，進行90 ℃、30 min保溫處理，而此時的SPI變性程度可以為以SPI為主要凝膠機制原料的大豆類產(chǎn)品凝膠提供工藝參考依據(jù)。

參考文獻：

[1] KATO A, TANIMOTO S, MURAKI Y, et al. Relationships between conformational stabilities and surface functional properties of mutant hen egg-white lysozymes constructed by genetic engineering[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1994, 42(1): 227-230.DOI:10.1021/jf00037a041.

[2] 李巖濤, 秦貴信, 龍國輝. 熱處理對β-伴大豆球蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響[J]. 吉林農(nóng)業(yè), 2013(2): 79-80. DOI:10.3969/j.issn.1674-0432.2013.04.065.

[3] WANG C H, DAMODARAN S. Thermal gelation of globular proteins:influence of protein conformation on gel strength[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1991, 39(3): 433-438. DOI:10.1021/jf00003a001.

[4] 周淑紅, 陳野, 張敏, 等. 鹽鹵濃漿豆腐凝膠形成作用力的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2013, 34(12): 15-19. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2013.12.005.

[5] 段文達, 翁頔, 潘思軼, 等. 分子間作用力對大豆蛋白凝膠形成的影響[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(13): 60-63. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2009.13.013.

[6] 包中宇. 超聲波技術(shù)對大豆分離蛋白功能性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及凝膠特性的影響[D]. 南昌: 南昌大學(xué), 2015: 40.

[7] KOSHIYAMA I. Chemical and physical properties of a 7S protein in soybean globulins[J]. Cereal Chemistry, 1968, 45(9): 394-404.

[8] CHURCH F C, HAROLD E, PORTE D H, et al. Spectrophotometric assay using o-phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins 1[J]. Journal of Dairy Science, 1983,66(6): 1219-1227. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(83)81926-2.

[9] BEVERIDGE T, TOMA S J, NAKAI S. Determination of SH- and SS-groups in some food proteins using Ellman’s reagent[J]. Journal of Food Science, 2006, 39(1): 49-51. DOI:10.1111/j.1365-2621.1974.tb00984.

[10] OBATA A, MATSUURA M. Decrease in the gel strength of tofu caused by an enzyme reaction during soybean grinding and its control[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1993, 57(4):542-545. DOI:10.1271/bbb.57.542.

[11] 閆潔. 方便豆腐腦粉加工技術(shù)的研究[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2008: 10.DOI:10.7666/d.y1397690.

[12] 李汴生. 超高壓處理對蛋白質(zhì)和多糖膠體特性的變化及其機理研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 1997: 20-21.

[13] 郭鳳仙. 熱處理對大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的影響[D]. 無錫:江南大學(xué), 2009: 13-19. DOI:10.7666/d.y1584043.

[14] 李慶云. 熱處理大豆分離蛋白乳濁液中油脂氧化與蛋白氧化相互作用關(guān)系研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 2016: 27.

[15] 郭鳳仙. 大豆蛋白在貯藏過程中品質(zhì)下降機制及控制途徑[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2015: 10-11.

[16] GERMAN B, DAMODARAN S, KINSELLA J E. Thermal dissociation and association behavior of soy proteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1982, 30(5): 807-811. DOI:10.1021/jf00113a002.

[17] MCKlEM L K. Investigation of molecular forces involved in gelation of commercially prepared soy protein isolates[D]. North Carolina:North Carolina State Univeraity, 2002: 23.

[18] SORGENTINI D A, WAGNER J R, ANON A C. Effects of thermal treatment of soy protein isolate on the characteristics and structurefunction relationship of soluble and insoluble fractions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1995, 43(9): 2471-2479.DOI:10.1021/jf00057a029.

[19] 馬丹, 張超, 馬越, 等. 熱處理對大豆分離蛋白可食性膜性能和結(jié)構(gòu)的影響[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(1): 102-104.

[20] 李里特, 汪立君, 李再貴, 等. 大豆蛋白熱變性程度對豆腐品質(zhì)的影響[J]. 中國糧油學(xué)報, 2002, 17(1): 1-4. DOI:10.3321/j.issn:1003-0174.2002.01.001.

[21] HASHIZUME K, MAEDA M, WATANABE W. Studies on the preparing conditionds of soybean milk for tofu making. II. relationship of heating and cooling condition to hardness of tofu[J]. Nihon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 1978, 25(7): 387-391.

[22] 王中江, 江連洲, 李楊, 等. 熱處理時間及溫度對大豆分離蛋白二級結(jié)構(gòu)及表面疏水性的影響[C]//中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會第九屆年會論文集, 哈爾濱: 中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會, 2012: 169-175.

[23] MATSUDOMI N, MORI H, KOBAYASHI K. Emulsifying and foaming properties of heat-denatured soybean 11S globulins in relation to their surface hydrophobicity[J]. Agricultural Biological Chemistry,1985, 49(4): 915-919. DOI:10.1080/00021369.1985.10866853.

[24] YUAN Y J, VELEV O D, CHEN K, et al. Effect of pH and Ca2+induced associations of soybean proteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(17): 4953-4958. DOI:10.1021/jf025582d.

[25] FENG H, XIONG Y L. Interaction of myofibrillar and preheatedsoy proteins[J]. Journal of Food Science, 2002, 67(8): 2851-2856.DOI:10.1111/j.1365-2621.2002.tb08827.

[26] 葉榮飛, 楊曉泉, 鄭田要, 等. 熱變性和熱聚集對大豆分離蛋白溶解性的影響[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(7): 106-108. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2008.07.019.

[27] PETRUCCELLI S, ANON M C. Thermal aggregation of soy protein isolates[J]. Journal Agricultural Food Chemistry, 1995, 43(12): 3035-3041. DOI:10.1021/jf00060a009.

[28] PLEITZ P, DAMASCHUN G. The structure of the 11S seed globulins from various plant species: comparative investigations by physical methods[J]. Studia Biophysical, 1986, 116(3): 153-173.

[29] MARCONE M F, BONDI M C, YADA R Y. Isolation of soybean 11S globulin by isoelectric precipitation and sephacryl S-300 gel filtration chromatography: a new purification technique[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1994, 58(2): 413-415. DOI:10.1271/bbb.58.413.

[30] 李楊, 王中江, 王瑞, 等. 不同熱處理條件下大豆分離蛋白的紅外光譜分析[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(8): 104-109. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.013.

[31] MILLS E N, HUANG L, NOELT R, et al. Formation of thermally induced aggregates of the soya globulin β-conglycinin[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology, 2001, 1547(2): 339-350. DOI:10.1016/S0167-4838(01)00199-6.

[32] 張海瑞, 何志勇, 秦昉, 等. 熱處理制備高凝膠性大豆分離蛋白的工藝[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2012, 38(3): 81-84. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2012.03.029.