脈沖射頻對坐骨神經(jīng)慢性壓迫大鼠降鈣素基因相關(guān)肽表達(dá)的遠(yuǎn)期影響①

付淼，任浩，羅芳

1.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所，惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室麻醉科，北京市100142；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院麻醉科，北京市100050

2008年國際疼痛學(xué)會將神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NP)定義為：“由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病所直接造成的疼痛”[1]。迄今臨床上仍缺乏針對NP的特異性治療，藥物治療NP沒有突破性進展。因此，探索治療NP的新方法極有必要。

Sluijter等[2]首次提出脈沖射頻這一非神經(jīng)毀損性的射頻技術(shù)。脈沖射頻是連續(xù)射頻技術(shù)的改進。射頻儀發(fā)射脈沖頻率2 Hz、輸出電壓45 V、頻率500 kHz的高頻交流電，每次射頻電流持續(xù)20 ms，間歇480 ms，使射頻電流在神經(jīng)組織附近產(chǎn)生的熱量得以擴散，電極尖端溫度不超過42℃，因而不會導(dǎo)致組織變性[3]。近年來，脈沖射頻無永久性神經(jīng)損傷的優(yōu)點使其越來越廣泛地用于臨床治療NP，療效確切，但作用機制尚不完全明確。由于脈沖射頻具有非神經(jīng)毀損的特性，故理論上可應(yīng)用于傷害性感受通路上各個靶點，既可作用于背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)[4-5]，也可作用于外周神經(jīng)。

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是一種含有37個氨基酸殘基的神經(jīng)肽，主要分布于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是DRG等。DRG中初級感覺纖維投射至脊髓后角，大部分為傳導(dǎo)痛覺的Aδ和C纖維[6]。在脊髓水平，CGRP通過蛋白激酶A和蛋白激酶C第二信使通路易化突觸痛覺信息的傳入，參與NP的產(chǎn)生和維持[7]。對正常大鼠周圍神經(jīng)行脈沖射頻，可使DRG中CGRP陽性神經(jīng)元比例下降[8]。我們以往的研究觀察到[9]，脈沖射頻治療后短期(2周)內(nèi)，NP模型痛敏改善，并伴有CGRP表達(dá)下調(diào)。本研究采用大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫(chronic constriction injury,CCI)模型模擬NP，觀察脈沖射頻治療后4周大鼠的疼痛行為學(xué)表現(xiàn)，并檢測各組大鼠DRG中CGRP的表達(dá)水平，旨在探討脈沖射頻的長期鎮(zhèn)痛效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

成年雄性Sprague-Dawley大鼠36只，體質(zhì)量220～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)于22～24℃、12 h明暗交替的環(huán)境中，自由取食。

隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和治療組，每組12只。

1.2 主要儀器及試劑

PMG-230型射頻疼痛治療儀：加拿大BAYLIS公司。Von Frey絲：美國STOELTING公司。Trizol試劑RNA提取試劑盒：美國INVITROGEN公司。qPCR試劑盒：美國THERMO FISHER SCIENTIFIC公司。PCR反應(yīng)儀：美國ABI公司。第一鏈cDNA合成試劑盒：美國NEB公司。CGRP ELISA試劑盒：中國伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.3 模型制備

參照Bennett等[10]的方法建立CCI模型。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，于右側(cè)大腿外側(cè)正中逐層切開，暴露坐骨神經(jīng)。模型組和治療組用4-0鉻腸線間隔1 mm將坐骨神經(jīng)結(jié)扎4道，逐層縫合后清潔創(chuàng)口。假手術(shù)組暴露坐骨神經(jīng)后不結(jié)扎。

1.4 干預(yù)方法

使用Bennett等[10]的方法，于術(shù)后第14天確認(rèn)大鼠CCI模型建立成功。治療組大鼠再次暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，將射頻疼痛治療儀的電極針垂直置于坐骨神經(jīng)結(jié)扎處，脈沖頻率2 Hz，電壓45 V，溫度不超過42℃，治療120 s。模型組和假手術(shù)組大鼠只暴露坐骨神經(jīng)、放置射頻電極針，不通電。

1.5 機械縮足反射閾值(hindpaw withdrawl threshold，HWT)測定

各組大鼠于脈沖射頻治療前(0 d)及治療后7 d、14 d、21 d、28 d采用HWT檢測大鼠患足的機械痛閾。將大鼠置于金屬網(wǎng)底的透明籠內(nèi)，預(yù)適應(yīng)2 h。采用不同壓力的Von Frey絲垂直刺激大鼠患足足底，使Von Frey絲輕微彎曲并持續(xù)3～5 s；從1 g開始，如無縮足反射則上升一個壓力級別；每個壓力刺激5次，5次刺激中有3次以上發(fā)生縮足反射即為該大鼠的HWT。測量3次，取平均值，每次測量間隔1 min。

1.6 RT-qPCR

治療后28 d，HWT測量后處死大鼠，快速取出右側(cè)L4-6DRG，保存于液氮中。組織等分為兩份，一份用于RT-qPCR檢測，一份用于ELISA檢測。采用Trizol提取DRG中mRNA。用第一鏈合成試劑盒將所提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA第一鏈。

CGRP mRNA引物序列：上游5'-CAG GAG GAG GAA CAG GAG GCT-3'；下游5'-TCT TGC CAG GTG CTC CAACC-3'。

內(nèi)參β-actin引物序列：上游5'-CCC ATC TAT GAG GGT TAC G-3'；下游5'-TTT AAT GTC ACG CAC GAT T-3'。

反應(yīng)條件參照PCR反應(yīng)儀和qPCR試劑盒說明書。用2-ΔΔCt法計算相對CGRP mRNA表達(dá)量。

1.7 ELISA

取另一份標(biāo)本，準(zhǔn)確稱重后勻漿，離心取上清。按照ELISA試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖計算樣品CGRP含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以±s)表示，HWT結(jié)果采用重復(fù)測量方差分析，RT-qPCR和ELISA結(jié)果采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HWT

治療前，模型組和治療組HWT均顯著低于假手術(shù)組(P＜0.001)，模型組和治療組間無顯著性差異(P＞0.05)。治療后，治療組HWT逐漸上升，7 d時即高于模型組(P＜0.05)，14 d時明顯高于模型組(P＜0.01)，但仍低于假手術(shù)組(P＜0.05)；治療后21 d、28 d時，治療組HWT顯著高于模型組(P＜0.001)，與假手術(shù)組無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 RT-qPCR

治療組CGRP mRNA水平明顯低于模型組(P＜0.01)，與假手術(shù)組無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

2.3 ELISA

治療組CGRP蛋白表達(dá)明顯低于模型組(P＜0.01)，與假手術(shù)組無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

3 討論

脈沖射頻臨床上已應(yīng)用于治療帶狀皰疹后神經(jīng)痛、三叉神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛等多種NP[11-13]。與傳統(tǒng)射頻熱凝神經(jīng)毀損術(shù)后常出現(xiàn)神經(jīng)損傷后遺癥相比，脈沖射頻治療罕見術(shù)后副作用的報道。目前脈沖射頻治療NP的靶點包括外周神經(jīng)和DRG，均取得較好療效[3,14]。尤其是將脈沖射頻作用于外周神經(jīng)，治療操作簡便，穿刺風(fēng)險小，可利用超聲定位，具有一定優(yōu)勢。

CCI模型[10]的行為學(xué)表現(xiàn)與人類NP相似。CCI模型大鼠的痛敏在脈沖射頻治療后7 d明顯改善，14 d后疼痛緩解更為顯著，與以往報道一致[15]。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，脈沖射頻治療后2周內(nèi)，可通過下調(diào)CGRP的表達(dá)緩解NP。本研究延長觀察時間至治療后4周。結(jié)果顯示在治療后21 d，大鼠痛敏有進一步改善，并達(dá)到鎮(zhèn)痛峰效果，并持續(xù)到治療后28 d。這可能基于某些神經(jīng)調(diào)控基因長時程表達(dá)改變。

表1 各組大鼠治療后各時間點HWT比較

表2 各組大鼠治療后28 d CGRP比較

本研究顯示，脈沖射頻治療后，疼痛緩解的最佳效果并非即刻產(chǎn)生，而是在治療后3周內(nèi)逐漸出現(xiàn)，與臨床應(yīng)用脈沖射頻治療NP患者后疼痛逐漸緩解的現(xiàn)象一致[16]。提示臨床應(yīng)用脈沖射頻治療后早期，應(yīng)繼續(xù)服用藥物，待療效出現(xiàn)后逐步減少藥物，避免過早停藥導(dǎo)致疼痛加重。

外周神經(jīng)損傷所致的NP可導(dǎo)致DRG或脊髓中CGRP表達(dá)上調(diào)[17-18]。外周神經(jīng)損傷后，大量DRG神經(jīng)元開始表達(dá)CGRP，并在疼痛的產(chǎn)生和維持中扮演重要角色[19]。抑制CGRP表達(dá)可緩解疼痛[20]。本研究顯示，脈沖射頻可能抑制大鼠DRG中CGRP的轉(zhuǎn)錄和翻譯。CGRP合成主要位于DRG，DRG的初級感覺神經(jīng)元發(fā)出神經(jīng)纖維投射至脊髓后角[21]。外周神經(jīng)損傷后，初級感覺纖維釋放CGRP、P物質(zhì)等，引起膠質(zhì)細(xì)胞活化，釋放多種疼痛調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與中樞敏化[22]。脈沖射頻可通過長時程下調(diào)CGRP的表達(dá)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

脈沖射頻的鎮(zhèn)痛作用可能存在多種相互聯(lián)系的機制，不限于CGRP。另外，不同時間點CGRP的表達(dá)與行為學(xué)變化的關(guān)系有待進一步研究。

綜上所述，脈沖射頻作用于外周神經(jīng)病變部位可有效治療NP，且效果較為持久。長時程下調(diào)DRG中CGRP的表達(dá)，可能是脈沖射頻治療NP的重要機制之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Treede RD,Jensen TS,Campbell JN,et al.Neuropathic pain:redefinition and a grading system for clinical and research purposes[J].Neurology,2008,70(18):1630-1635.

[2]Sluijter ME.Pulsed radiofrequency[J].Anesthesiology,2005,103(6):1313;author reply 1313-1314.

[3]Abd-Elsayed A,Anis A,Kaye AD.Radio frequency ablation and pulsed radiofrequency for treating peripheral neuralgias[J].Curr Pain Headache Rep,2018,22(1):5.

[4]Kim K,Jo D,Kim E.Pulsed Radiofrequency to the dorsal root ganglion in acute herpes zoster and postherpetic neuralgia[J].Pain Physician,2017,20(3):E411-E418.

[5]Albayrak I,Apiliogullari S,Dal CN,et al.Efficacy of pulsed radiofrequency therapy to dorsal root ganglion adding to TENS and exercise for persistent pain after total knee arthroplasty[J].J Knee Surg,2017,30(2):134-142.

[6]Schou WS,Ashina S,Amin FM,et al.Calcitonin gene-related peptide and pain:a systematic review[J].J Headache Pain,2017,18(1):34.

[7]Russell FA,King R,Smillie SJ,et al.Calcitonin gene-related peptide:physiology and pathophysiology[J].Physiol Rev,2014,94(4):1099-1142.

[8]Hamann W,Abou-Sherif S,Thompson S,et al.Pulsed radiofrequency applied to dorsal root ganglia causes a selective increase in ATF3 in small neurons[J].Eur J Pain,2006,10(2):171-176.

[9]Ren H,Jin H,Jia Z,et al.Pulsed radiofrequency applied to the sciatic nerve improves neuropathic pain by down-regulating the expression of calcitonin gene-related peptide in the dorsal root ganglion[J].Int J Med Sci,2018,15(2):153-160.

[10]Bennett GJ,Xie YK.A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man[J].Pain,1988,33(1):87-107.

[11]孫臣琛,劉金鋒.背根神經(jīng)節(jié)介入治療帶狀皰疹后神經(jīng)痛研究進展[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志,2017,23(2):130-134.

[12]韓衛(wèi)江,李霞,方梅,等.半月神經(jīng)節(jié)重復(fù)脈沖射頻治療三叉神經(jīng)痛的臨床觀察[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志,2017,23(5):392-394.

[13]賈怡童,羅芳.脈沖射頻技術(shù)用于神經(jīng)病理性疼痛的治療參數(shù)研究進展[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志,2017,23(7):481-486.

[14]Pope JE,Deer TR,Kramer J.A systematic review:current and future directions of dorsal root ganglion therapeutics to treat chronic pain[J].Pain Med,2013,14(10):1477-1496.

[15]賈子普,任浩,李倩,等.脈沖射頻對慢性坐骨神經(jīng)縮窄傷大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2016,22(1):53-57.

[16]Fang L,Ying S,Tao W,et al.3D CT-guided pulsed radiofrequency treatment for trigeminal neuralgia[J].Pain Pract,2014,14(1):16-21.

[17]Hirose K,Iwakura N,Orita S,et al.Evaluation of behavior and neuropeptide markersofpain in a simple,sciatic nerve-pinch pain model in rats[J].Eur Spine J,2010,19(10):1746-1752.

[18]Sugawara S,Okada S,Katagiri A,et al.Interaction between calcitonin gene-related peptide-immunoreactive neurons and satellite cells via P2Y12R in the trigeminal ganglion is involved in neuropathic tongue pain in rats[J].Eur J Oral Sci,2017,125(6):444-452.

[19]Ishikawa T,Miyagi M,Yamashita M,et al.In-vivo transfection of the proopiomelanocortin gene,precursor of endogenous endorphin,by use of radial shock waves alleviates neuropathic pain[J].J Orthop Sci,2013,18(4):636-645.

[20]La Rana G,Russo R,D'Agostino G,et al.AM404,an anandamide transport inhibitor,reduces plasma extravasation in a model of neuropathic pain in rat:role for cannabinoid receptors[J].Neuropharmacology,2008,54(3):521-529.

[21]Iyengar S,Ossipov MH,Johnson KW.The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine[J].Pain,2017,158(4):543-559.

[22]McMahon SB,Cafferty WB,Marchand F.Immune and glial cell factors as pain mediators and modulators[J].Exp Neurol,2005,192(2):444-462.