白及無菌苗繁育技術優(yōu)化研究

項彬 ，李湘英 ，方笑中 ，肖圓 ，史廷先 ，

（1.黃山峰源生物科技有限公司，安徽 黃山245600；2.祁門縣木材公司，安徽 黃山 245600；3.祁門縣林業(yè)局，安徽 黃山245600）

白及（Bletilla striata）為蘭科白及屬多年生草本植物，植株高20～60 cm。世界范圍內白及屬植物共有6種，主要分布在緬甸、中國和日本。我國有4種，分別為白及、黃花白及（B.ochracea）、華白及（B.sinensis）和小白及（B.formosana）[1]。4 種白及植物中只有白及被載入《中國藥典》[2-4]。用白及假鱗莖曬干制成的中藥，具有收斂止血、消腫生肌等功效。研究表明，白及具有止血、抗腫瘤、抗菌、促進創(chuàng)傷愈合、促進細胞生長等多種藥理活性[5-7]。白及提取物是一種優(yōu)良的生物高分子材料和優(yōu)良的藥用輔料[5,8-9]。此外，白及在食品、紡織印染、特殊涂料和日用化工等方面也有著巨大的利用價值。

目前，由于野生資源已經非常稀少，白及已被列為我國珍稀瀕危物種之一。據蘇鈦等人調查[2]，野生白及種群密度極小，1～2年的已不多見，3年生及以上的也很難見到。資源嚴重枯竭，加上藥農連年的亂采濫挖，使野生白及產量急劇下降，市場供需矛盾日益突出，野生資源日益短缺。

為解決白及野生藥用資源面臨的短缺危機，近年來一些科技工作者圍繞白及資源和人工繁育開展了白及野生變家種、種子無菌化育苗、無菌苗馴化、大田和林下種植等關鍵技術研究，總結出了白及培育及馴化、馴化苗栽植、栽后管理等技術，為白及人工栽培創(chuàng)造了有利條件。黃山峰源生物科技有限公司（以下簡稱“峰源生物公司”）在安徽中醫(yī)藥大學俞年軍導師的指導和幫助下，在MS培養(yǎng)基中添加NAA激素、香蕉、馬玲薯等物質改良MS培養(yǎng)基，改進初代苗和繼代苗接種技術，采用不同光照強度以及溫度控制等措施，促成白及組培苗快速生長。通過反復試驗，組合配套并優(yōu)化了白及（無菌）組培苗的繁育工藝流程，提高了白及組培苗繁育效率和質量，培育了大批優(yōu)質白及種苗，有效推動了祁門縣林下經濟發(fā)展，增加了林地復合經營效益，助推了林區(qū)精準扶貧進程。同時，公司還培養(yǎng)了大批操作熟練、業(yè)務精通涵蓋環(huán)境消毒、培養(yǎng)基制備、瓶苗接種、光照培育以及白及苗馴化、林下栽培等方面的技術人才。

1 白及無菌苗繁育概況

峰源生物公司建有潔凈度萬級以上實驗室和工廠化育苗車間3 000 m2，擁有清洗、制備、接種和培育員工36人；新建白及瓶苗馴化基地15 hm2，一期建成大棚30個，二期擬建25個；工廠采用先進的自動控制系統(tǒng)，智能控溫、間斷光照、無塵控制育苗，年設計生產白及無菌瓶苗100萬瓶；現(xiàn)已生產白及無菌繼代瓶苗80萬瓶，約2 400萬株，其中大棚馴化苗約1 000萬株。通過改進白及苗組培工藝，優(yōu)化制備、接種、培養(yǎng)等工序，使白及瓶苗產量更高、質量更好。如按人均每天接種300瓶、轉接苗數(shù)32株/瓶計算，人均年轉接量近11萬瓶。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 蒴果處理、培養(yǎng)基配制材料

白及蒴果、超凈工作臺、10%次氯酸鈉溶液、無菌水、75%酒精、不銹鋼盤、鑷子等；MS培養(yǎng)基、NAA激素、香蕉、馬鈴薯、蔗糖、瓊脂等。

2.1.2 接種與溫光控制材料

不銹鋼盤、鑷子，容積為250 mL培養(yǎng)瓶（瓶中MS培養(yǎng)基量≥62.5 mL）、750 mL培養(yǎng)瓶（瓶中MS培養(yǎng)基量≥125 mL）等，空調系統(tǒng)、強度為2 000～3 000 Lux·m-2·s-1可控光源等。

2.2 方法

2.2.1 蒴果處理、培養(yǎng)基配制

（1）蒴果處理：從冰箱取出白及蒴果，在超凈工作臺內，用10%次氯酸鈉溶液浸泡20 min，期間要不時搖晃，然后用無菌水沖洗3～5遍，再用75%酒精擦拭表面，置于滅菌過的不銹鋼盤內風干表面水分備用。

（2）改良MS培養(yǎng)基配制：在MS培養(yǎng)基中分別添加30 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂、50 g/L香蕉果肉、50 g/L馬鈴薯肉作為白及初代苗培養(yǎng)基；在MS基本培養(yǎng)基中添加NAA 0.5 mg/L后，再分別添加：A、50 g香蕉/L+50 g馬玲薯/L；B、只添加 50 g香蕉/L；C、只添加50 g馬玲薯/L；D、香蕉、馬玲薯均不添加，分別作為白及繼代苗培養(yǎng)基。

2.2.2 接種與接種人員

將處理后的白及蒴果剝開，取出細小種子放入無菌盤中，用高溫滅菌降溫后的鑷子夾取一定量的種子，均勻撒播到容積為250 mL培養(yǎng)瓶里（瓶中MS培養(yǎng)基量≥62.5 mL），置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)。接種后1～10 d內統(tǒng)計每天瓶苗污染數(shù)量。

轉接用瓶苗苗齡＞60 d的初代苗；轉接熟練人員分為3組，其中男性1組，女性2組（1組常規(guī)接種，另1組使用組培輔助工具支架接種）。接種要求如下：將培養(yǎng)好的初代白及苗轉接到750 mL培養(yǎng)瓶里，瓶中MS培養(yǎng)基量≥125 mL，瓶中轉接白及初代苗≥32株。每組分別接種上述苗齡白及苗300瓶，標記后送培養(yǎng)室培養(yǎng)，并統(tǒng)計每組接種速度、接種后1～10 d污染數(shù)量及40 d后瓶苗質量，確定最快接種組和最優(yōu)接種方法。

2.2.3 溫度與光照控制

轉接后的白及瓶苗，由傳遞人員通過傳遞窗送至培養(yǎng)室進行光照培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度控制在（25±2）℃，光照 12 h，光照強度為 2 500～3 000 Lux·m-2·s-1，培養(yǎng)60 d以上。

3 結果與分析

2.2.4 季節(jié)與輔助工具

接種季節(jié)不同，其環(huán)境溫度、空氣濕度、單位體積空氣中細（真）菌含量、接種室內空氣潔凈度不同，直接影響到瓶苗污染程度。

接種人員使用輔助工具—一種接種支架，能提高接種速度，相應減少瓶苗污染。

3.1 培養(yǎng)基、激素對白及瓶苗生長及質量的影響

白及種子在自然狀態(tài)下萌發(fā)率很低，通過無菌組織培養(yǎng)，以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加蔗糖、瓊脂、香蕉果肉、馬鈴薯肉可大大提高白及種子萌發(fā)率。通過本方法的試驗，白及接種7～9 d種子開始萌發(fā)，20～25 d絕大部分種子萌發(fā)。在不添加激素的條件下，播種時添加香蕉、馬鈴薯處理和不添加香蕉和馬鈴薯的改良MS培養(yǎng)基上的白及種子萌發(fā)時間基本一致，出芽均比較整齊。

待形成原球莖的白及苗高1.5～2 cm，將其轉接到分別添加了NAA、香蕉、馬鈴薯的改良MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，40 d后白及苗高生長達5 cm以上，60 d后可煉苗和馴化。由表1可知，在MS培養(yǎng)中添加0.5 mg/L NAA后，4個處理中，白及轉接培養(yǎng)60 d后，苗高、葉寬、假鱗莖等生長指標均存在一定差異。其中處理A在苗高、葉寬、假鱗莖等指標上表現(xiàn)最佳。而處理B和處理C又優(yōu)于處理D。由此可見，添加了NAA、香蕉和馬鈴薯的改良MS培養(yǎng)基，更有利于白及繼代苗的生長。

表1 不同添加物對白及繼代苗生長的影響

3.2 人員對接種速度和瓶苗質量的影響

不同接種人員因接種手法、熟練程度、操作技巧等不同，其接種速度與接種后瓶苗長勢及瓶苗質量均有一定差異。由表2可知，接種人員甲8月27日、9月22日和10月20日分別接種60瓶、95瓶和120瓶，而接種人員乙在相同時間里分別接種80瓶、100瓶和125瓶?？梢姡煌臃N人員接種速度是不同的，其單位時間內的接種速度是隨接種年（月）齡的增加而增加的。

瓶苗質量除與培養(yǎng)基種類、接種時初代苗大小、質量，培養(yǎng)室光照、溫度及培養(yǎng)時間等有密切相關外，還與接種人員技術熟練程度、接種質量有密切聯(lián)系。如表2所示，接種人員乙技術熟練、接種速度快，其接種的白及苗高、葉長、葉寬等生長指標均較好。

表2 不同接種人員對接種速度和種苗質量

3.3 環(huán)境因素對瓶苗生長及質量的影響

3.3.1 溫度對瓶苗生長及質量的影響

瓶苗苗齡、接種人員、接種批次、接種數(shù)量、培養(yǎng)室光照時間等均相同，培養(yǎng)室最下層培養(yǎng)架上的培養(yǎng)瓶與上面3層培養(yǎng)架上的培養(yǎng)瓶溫度略有差異，其生長指標和質量與上面3層相比，存在一定差異。對培養(yǎng)90 d的不同層架上的白及苗生長指標進行了測定和統(tǒng)計，結果見表3。

由表3可知，上面第1層至第3層，瓶苗株數(shù)、葉長、葉數(shù)、苗高均大于第4層；而葉寬、假鱗莖直徑均小于第4層。可見，溫度略高，有利于瓶苗高生長和小苗分化；溫度略低，有利于瓶苗葉寬和假鱗莖生長。

表3 培養(yǎng)室同架不同層白及苗生長表現(xiàn)

3.3.2 光照對瓶苗生長及質量的影響

由表4可知，在培養(yǎng)室環(huán)境溫度、培養(yǎng)時間、光照周期等均相同的條件下，白及繼代苗在不同光照強度下，其苗高、葉長、葉寬、假鱗莖大小等指標均有一定差異。如光照強度分別為2 500 Lux·m-2·s-1和3 000 Lux·m-2·s-1，每天照射 12 h，培養(yǎng) 90 d，白及苗平均高、葉長、葉寬、假鱗莖直徑分別為10.9 cm、11.8 cm，7.3 cm、7.4 cm，0.6 cm、0.7 cm，0.32 cm、0.33 cm，可見，白及苗生長更適宜于3 000 Lux·m-2·s-1光照。

表4 光照強度對白及苗高、假鱗莖等生長指標影響調查

3.4 輔助工具對接種速度及質量的影響

在一定條件下，接種人員使用接種輔助工具——接種支架，能大幅度提高接種速度，減少瓶苗污染，提高瓶苗質量。在超凈工作臺內放1～2個金屬接種支架，分別放初代瓶苗和待接種的繼代苗瓶，接種人員從初代瓶中取出小苗，然后直接接種到另一個支架上的繼代瓶中。由于使用接種支架減少了取苗、分苗的過程，縮短了白及小苗在空氣中的停留時間，提高了轉接速度，大大降低了瓶苗的污染率，相應地也提升了轉接苗的質量。據測算，使用接種輔助工具，白及苗轉接速度由原來的11.25瓶/h，提高到現(xiàn)在的37.5瓶/h，效率提高3倍多。

3.5 季節(jié)對瓶苗污染的影響

接種季節(jié)（日期）不同，其環(huán)境溫度、空氣濕度、單位體積空氣中細（真）菌含量、接種室內空氣潔凈度不同，轉接后一定時期內瓶苗污染率也不相同。由表5可知，不同季節(jié)接種的瓶苗，接種后一定時間內瓶苗的污染數(shù)量和污染率也不相同。如2016年7月份，工廠剛正式生產，制備室、接種室、培養(yǎng)室等環(huán)境優(yōu)越，空氣潔凈度高（萬級以上），接種后瓶苗污染數(shù)及污染率相對較低，日平均污染數(shù)為56.3瓶，污染率為8.1%。8月份，因空氣含菌量相對增高，環(huán)境質量變差，日污染量增加，污染率上升，達到9.3%。

表5 不同接種季節(jié)對白及轉接瓶苗污染的影響

4 結語與建議

目前，白及苗無菌化人工繁育，大田、杉木、毛竹林下種植及經營期管理技術已日臻成熟[10]，白及種植戶已積累了豐富的大田種植經驗，如祁門縣安凌鎮(zhèn)的桂小林，柏溪鄉(xiāng)的蔣紀澤等10余戶種植白及約1.5 hm2，其中兩戶2016年已獲得可觀的經濟效益，并輻射帶動了一批農戶栽植白及。為使白及種植技術規(guī)范化、面積規(guī)?；?、經營集約化、效益最大化，推進各地林下經濟發(fā)展，加快各地精準扶貧進程，提出以下建議。

4.1 建立林下白及種植示范基地

當?shù)卣畱鶕^(qū)域內林地資源狀況、白及種苗供應能力，以及目前已具備的栽培、管理和病蟲害防治技術等條件，扶持和鼓勵相關企業(yè)或種植大戶，積極開展縱向或橫向合作，走“企業(yè)+基地+農戶”的發(fā)展模式，建立林下白及種植示范基地，開展集約化、規(guī)?；洜I，提高林地復合經營效益，輻射帶動周邊鄉(xiāng)鎮(zhèn)發(fā)展林下白及種植，增加林地經營收入，致富山區(qū)群眾，推進當?shù)亟洕l(fā)展。

4.2 鼓勵貧困戶開展林下白及種植，推進精準扶貧進程

結合當前黨和政府加強扶貧攻堅的大好機遇，解放思想，拓寬思路，創(chuàng)新機制，上牽下聯(lián)，爭取項目資金，鼓勵貧困戶開展林下白及種植，增加其經濟收入，推進當?shù)鼐珳史鲐氝M程。

4.3 開展林下白及種植技術培訓，推廣白及與其他中藥材復合經營

組織白及種植大戶到白及產區(qū)進行考察和學習，掌握白及種植與管理技術和經驗；白及種苗培育企業(yè)，要積極與科研單位建立長期合作關系，并邀請白及研究專家來當?shù)亻_展技術培訓，提高白及種植者經營管理水平；大力推廣白及與其他中藥材復合經營技術，如白及與覆盆子套種、杉木下套種白及等，增加中藥材復合經營效益。

4.4 出臺優(yōu)惠政策，扶持林下經濟發(fā)展

為鼓勵社會各界大力發(fā)展林下白及等中藥材種植，加快祁門縣林下經濟發(fā)展，政府應積極整合林業(yè)、農業(yè)、水利、農發(fā)、財政和扶貧資金，鼓勵并扶持相關企業(yè)和中藥材種植大戶進行林下中藥材種植，推進林下經濟健康、長足發(fā)展，繁榮山區(qū)經濟，建設生態(tài)、美好家園。

參考文獻:

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