空氣霉菌總數(shù)測(cè)定方法分析

劉劍，劉艷芳，楊玉萍，王沖文，戈帆

（國(guó)營(yíng)第二九八廠，昆明 650114）

霉菌在武器裝備上生長(zhǎng)時(shí)，新陳代謝分泌的有機(jī)酸會(huì)腐蝕紅外材料、金屬、橡膠等，分泌的水分會(huì)增加機(jī)殼內(nèi)濕度，從而影響裝備的力學(xué)性能和外觀、導(dǎo)致電子裝置短路、光學(xué)裝置精度降低等。紅外光學(xué)薄膜中的碳膜還為霉菌提供了豐富的碳源，為霉菌腐蝕創(chuàng)造了條件[1]。目前，霉菌腐蝕已成為武器裝備常見的腐蝕之一，更是光學(xué)儀器三害之一，尤其在高溫高濕環(huán)境中，霉菌生長(zhǎng)條件適宜，繁殖速度快，空氣霉菌含量高，武器裝備長(zhǎng)霉的概率也相應(yīng)增加，加速了霉菌對(duì)武器裝備的腐蝕。由于紅外材料及其涂鍍件對(duì)霉菌腐蝕較為敏感，因此在高溫高濕、適宜霉菌生長(zhǎng)的環(huán)境中，檢測(cè)空氣霉菌總數(shù)可以監(jiān)測(cè)空氣霉菌數(shù)量變化情況，評(píng)估武器裝備（尤其是紅外產(chǎn)品）在貯存和使用過程中的長(zhǎng)霉概率。同時(shí)也是空氣霉菌采集、鑒定的基礎(chǔ)，為防霉技術(shù)研究提供數(shù)據(jù)支撐。

西雙版納熱帶雨林自然環(huán)境試驗(yàn)站屬于高溫、高濕環(huán)境，霉菌生長(zhǎng)旺盛，對(duì)站內(nèi)貯存的武器裝備試驗(yàn)樣品腐蝕較為明顯。對(duì)此，筆者進(jìn)行了較長(zhǎng)時(shí)間的空氣霉菌總數(shù)監(jiān)測(cè)和防霉研究。

GB/T 18204.3—2013《公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法第3部分：空氣微生物》規(guī)定兩種空氣真菌總數(shù)測(cè)定方法——自然沉降法和撞擊法[2]，最初采用自然沉降法進(jìn)行空氣霉菌總數(shù)測(cè)定。經(jīng)過幾次測(cè)定以及對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，發(fā)現(xiàn)自然沉降法測(cè)定結(jié)果在定性和定量上缺乏準(zhǔn)確性，通過奧梅梁斯基換算方程式（1）換算的結(jié)果沒有體現(xiàn) Stokes定律中相關(guān)因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

式中：C為活菌粒子數(shù)，cfu/m3；N為經(jīng)培養(yǎng)后平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)；A為所用平板的面積，cm2；t為平板暴露時(shí)間，min。

為了更準(zhǔn)確測(cè)定空氣霉菌總數(shù)，購(gòu)置了六級(jí)篩孔撞擊式空氣微生物采樣器，用撞擊法測(cè)定空氣霉菌總數(shù)。目前對(duì)自然沉降法和撞擊法的研究大多在室內(nèi)進(jìn)行，但文中開展的空氣霉菌相關(guān)研究還涉及室外空氣霉菌采集。文中將對(duì)兩種采樣方法在空氣霉菌總數(shù)測(cè)定中的應(yīng)用及測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，選擇穩(wěn)定性更高的方法進(jìn)行測(cè)量，為防霉技術(shù)研究提供更為可靠的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基和器材

試驗(yàn)以沙氏培養(yǎng)基作為空氣霉菌采集載體，用到的主要器材有φ90 mm玻璃平板（購(gòu)自云南新茂科研器材開發(fā)公司）、六級(jí)篩孔撞擊式空氣微生物采樣器（購(gòu)自美國(guó) SKC公司）、高溫高壓滅菌鍋（購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、霉菌培養(yǎng)箱等（購(gòu)自常州普天儀器制造有限公司）。

1.2 采樣原理

自然沉降法是在地心引力作用下，空氣中懸浮的帶菌顆粒會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸沉降[3]，降落在自然沉降法采樣使用的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面上。撞擊法是采用撞擊式空氣微生物采樣器采樣，通過抽氣動(dòng)力作用，使空氣通過狹縫或小孔而產(chǎn)生高速氣流，使懸浮在空氣中的帶菌粒子撞擊到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上。

1.3 采樣

在昆明室內(nèi)、室外，西雙版納室外各選擇一個(gè)采樣點(diǎn)，分別標(biāo)記為1#，2#，3#，在同一采樣點(diǎn)的同一時(shí)間段，用自然沉降法和撞擊法測(cè)定空氣霉菌總數(shù)。由于撞擊式空氣微生物采樣器產(chǎn)生高速氣流能更快地收集空氣微生物，采樣時(shí)間設(shè)計(jì)時(shí)撞擊法多一個(gè)梯度。在昆明用自然沉降法測(cè)定空氣霉菌總數(shù)的空氣采集時(shí)間以5，10，15 min為梯度，撞擊法以2，5，10，15 min為梯度進(jìn)行采樣。西雙版納屬于典型熱帶雨林氣候，霉菌生長(zhǎng)旺盛，只能進(jìn)行短時(shí)間的采樣，所以自然沉降法以1 min為空氣采集時(shí)間，撞擊法以0.5，1 min為梯度進(jìn)行采樣。兩種采樣方法均以1.5 m為采樣高度。在同一采樣點(diǎn)用同一種方法按同一采樣時(shí)間采集的樣品為一組，每組設(shè)置三個(gè)平行樣品。采集了空氣霉菌的平板倒置在（28±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

表1 采樣計(jì)劃

1.4 計(jì)數(shù)與計(jì)算

隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，采樣平板上的霉菌逐漸長(zhǎng)大，形成菌落，如圖2所示。培養(yǎng)至第3，5，7天時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)，獲得各皿平板霉菌菌落總數(shù)。通過格魯布斯檢驗(yàn)式（2）求出Gi，取置信區(qū)間為99%，臨界值G99（3）=1.15，即Gi＞1.15，則判定為離群值，應(yīng)舍去；Gi＜1.15，則判定為正常值。平行樣品的平均值即為最終平板生長(zhǎng)的霉菌菌落數(shù)，自然沉降法按奧梅梁斯基公式換算成空氣霉菌總數(shù)，撞擊法按式（3）計(jì)算，以cfu/m3表示計(jì)算結(jié)果。

式中：Xi為樣本中的可疑值；X為樣本平均值；S為樣本標(biāo)準(zhǔn)差。

式中：N 為經(jīng)培養(yǎng)后平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)；t為采樣時(shí)間。

2 結(jié)果與討論

2.1 平板計(jì)數(shù)結(jié)果

按表1采集17組空氣樣本，每組3個(gè)平行樣，共獲得51皿采集了空氣樣本的平板。經(jīng)過三次計(jì)數(shù)，獲得平板上生長(zhǎng)的霉菌菌落數(shù)，自然沉降法采樣計(jì)數(shù)結(jié)果見表2，撞擊法采樣計(jì)數(shù)結(jié)果見表 3，并計(jì)算各組霉菌菌落數(shù)的變異系數(shù)CV。

由表2可以看出，用自然沉降法采樣的7組試驗(yàn)最大變異系數(shù)1.14，最小0.458，平均0.704。由表3可以看出，用撞擊法采樣的10組試驗(yàn)最大變異系數(shù)0.948，最小 0.093，平均 0.375?？梢娮矒舴ú蓸佑?jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)比沉降法小。

1#為室內(nèi)采樣，2#為室外采樣。由圖3可以看出，在室內(nèi)用沉降法采樣時(shí)，計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)基本不受采樣時(shí)間影響，但在室外，隨采樣時(shí)間的增加，變異系數(shù)在逐漸減小。用撞擊法在室內(nèi)外采樣計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)均隨采樣時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)，但在室內(nèi)采樣的變化較小。變異系數(shù)反應(yīng)了數(shù)據(jù)的離散程度，由于室外空氣流動(dòng)較快，致使采樣結(jié)果較分散，但根據(jù)環(huán)境條件適當(dāng)增加采樣時(shí)間，有利于降低數(shù)據(jù)的離散程度。

表2 自然沉降法采樣計(jì)數(shù)結(jié)果

表3 撞擊法法采樣計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2 格魯布斯驗(yàn)證

為了剔除離群值，用格魯布斯檢驗(yàn)法對(duì)平板計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)，三個(gè)平行樣品中與平均值偏差最大的值視為可疑值，用式（2）檢驗(yàn)是否屬于離群值。檢驗(yàn)結(jié)果見表4和表5。

經(jīng)檢驗(yàn)，自然沉降法在1#采樣點(diǎn)采樣5 min的數(shù)據(jù)有一個(gè)離群值，撞擊法在2#采樣點(diǎn)采樣2 min的數(shù)據(jù)有一個(gè)離群值，剔除這兩個(gè)數(shù)據(jù)后再計(jì)算空氣中霉菌總數(shù)。兩個(gè)離群值均是在較短采樣時(shí)間產(chǎn)生的，而較長(zhǎng)時(shí)間的采樣均未出現(xiàn)離群值，故適當(dāng)增加采樣時(shí)間能降低瞬時(shí)環(huán)境因素對(duì)采樣結(jié)果的影響。

表4 自然沉降法采樣檢驗(yàn)結(jié)果

表5 撞擊法法采樣檢驗(yàn)結(jié)果

2.3 空氣霉菌總數(shù)計(jì)算

將自然沉降法和撞擊法采樣計(jì)數(shù)結(jié)果換算成每立方米的空氣霉菌總數(shù)。由圖4可看出，沉降法在室內(nèi)采樣計(jì)算結(jié)果比撞擊法高出許多，但在室外，兩種采樣方法比較接近。在室內(nèi)，隨采樣時(shí)間的增加，兩種方法采樣結(jié)果都呈下降趨勢(shì)，沉降法減少量更大。在室外，沉降法采樣結(jié)果隨時(shí)間增加有略微上升，而撞擊法的變化量很小。3#采樣點(diǎn)用撞擊法采樣0.5 min和1 min的結(jié)果差異較大，是因?yàn)? min采集到霉菌太多，生長(zhǎng)慢的霉菌在第二次計(jì)數(shù)時(shí)已被覆蓋，所以結(jié)果偏小。

總體來(lái)說(shuō)，無(wú)論在室內(nèi)還是室外采樣，在15 min的采樣時(shí)間內(nèi)，撞擊法受采樣時(shí)間的影響較小。兩種方法在室外采樣結(jié)果也比較接近，所以撞擊法也是可以用于室外空氣霉菌采樣的。3#采樣點(diǎn)空氣霉菌數(shù)量較多，用撞擊法只能進(jìn)行0.5 min的采樣。

3 結(jié)論

通過對(duì)比自然沉降法和撞擊法采樣結(jié)果，撞擊法計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)較小，平行樣相對(duì)離散程度較低，重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果較穩(wěn)定。

適當(dāng)增加采樣時(shí)間，有利于降低數(shù)據(jù)的離散程度，但在空氣霉菌總數(shù)未知的環(huán)境中，只能憑經(jīng)驗(yàn)選定采樣時(shí)間。撞擊法采樣結(jié)果受采樣時(shí)間影響較小，可以降低因選擇的采樣時(shí)間較短引起的試驗(yàn)誤差。

兩種方法在室外測(cè)定空氣霉菌總數(shù)的結(jié)果比較接近，但撞擊法采樣的計(jì)數(shù)結(jié)果變異系數(shù)小，受采樣時(shí)間影響小。說(shuō)明撞擊法測(cè)定空氣霉菌總數(shù)穩(wěn)定性更好，測(cè)定空氣霉菌總數(shù)可以盡量選用撞擊法。

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