正交試驗優(yōu)化沙地油栗硒多糖提取工藝研究

余小雙，徐元芬，張 馳,2*

(1.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000)

板栗是我國栽培最早的果樹之一 ,具有養(yǎng)胃健脾 、補腎強筋 、活血止血、增強免疫等功效,具有顯著的藥用價值和保健功能 , 深受國內(nèi)外消費者的青睞[1]。板栗營養(yǎng)價值很高, 含淀粉 51 %～60%, 蛋白質(zhì) 5.7%～10.7 %, 脂肪 2.0%～7.4 %,多糖 、粗纖維 、胡蘿卜素、維生素 A、B、C及鈣 、磷 、鉀等礦物質(zhì)[2]。硒元素是人體必需的微量也是重要的礦物質(zhì)營養(yǎng)素，是人體健康和動物體內(nèi)必需的 14 種微量元素之一, 兼具營養(yǎng)、毒性和解毒三重生物學(xué)功能, 被稱為生命的保護劑[3-4]。全世界大都屬于缺硒地區(qū)，恩施作為世界硒都，擁有豐富的生物硒資源。通過高硒地區(qū)植物的轉(zhuǎn)化作用將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒，通過開發(fā)含硒化合物，不僅可以作為一種天然的補硒劑，也可以作為抗氧化和衰老的保健品，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟和社會效益，具有良好的開發(fā)前景。硒多糖具有抗金屬中毒作用、抗氧化、抗癌細胞和病毒作用。本研究選取恩施產(chǎn)富硒板栗，研究得到硒多糖提取的最佳工藝條件,對于促進富硒農(nóng)產(chǎn)品開發(fā), 提高人體硒的攝入量, 對于提高缺硒地區(qū)、缺硒居民群體的健康水平具有重要的意義，對以后硒的開發(fā)利用奠定了理論和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

恩施市沙地鄉(xiāng)富硒板栗。

1.2 試劑與儀器

苯酚(AR)，濃硫酸(AR)，氯仿(AR)，正丁醇(AR)，葡萄糖(AR)，乙醚(AR)，無水乙醇(AR)；硒標準溶液(100μg/mL)，中國計量科學(xué)研究院；實驗用水為雙蒸水和超純水。 FA1004B電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；G80w 23CSL-F9(SO)型微波爐：Galanz 格蘭仕；HWS26型數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；GXZ-9140數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；TDL-80-2B低速臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；WFJ 7200型可見分光光度計：尤尼科(上海)儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計:北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ALPHA 2-4 LSC冷凍干燥機：德國Marin Christ 公司；SH220石墨消解儀：濟南海能儀器有限公司；AFS-930 d原子熒光光度計：北京吉天儀器有限公司；超純水器(HUMAN)：韓國。

1.3 實驗方法與步驟

1.3.1 葡萄糖標準曲線的制作

標準葡萄糖溶液的配制：準確稱取0.01 g的葡萄糖(烘干至很重)，定容至100 mL，即得0.1 mg/mL的標準葡萄糖溶液，在490 nm波長下測定其吸光度。

1.3.2 同單因素條件下提取板栗硒多糖

1.3.2.1 樣品的制備

板栗→剝殼→烘干→磨粉→過篩(80目)→置于干燥器中保存待用。

1.3.2.2 硒多糖的提取

硒多糖的提取分離[5-7]：板栗粉(0.1g)樣品→熱水浸提→離心(6000r/min、10min)→取上清液→醇沉(加四倍體積乙醇、4℃冰箱過夜)→離心(6000r/min、10min)→取沉淀定容至50mL→測多糖和硒含量。

1.3.2.3 多糖提取單因素實驗

研究四個單因素對板栗多糖提取效果的影響，分別為：不同超聲波[8-10]處理時間(5、10、15、20、25min)；不同水浴浸提溫度(40、50、60、70、80℃)；不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)；不同浸提時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)。設(shè)計四因素三水平正交試驗方案，研究其最佳提取工藝。

(1)因素A:超聲波處理不同時間(其它因素：溫度60℃、浸提時間0.5h、料液比為1∶30)。

(2)因素B:不同溫度(其它因素：超聲波10min、浸提時間0.5 h、料液比為1∶30)。

(3)因素C:不同料液比(其它因素：超聲波10min、水浴溫度60℃、浸提時間0.5 h)。

(4)因素D:不同的浸提時間(其它因素：超聲波10min、料液比：1∶30、水浴浸提溫度60℃)。

1.3.3 硒多糖提取正交實驗的設(shè)計

提取因素水平確定見表1。

表1 因素水平表

1.3.4 多糖及硒含量的測定

多糖含量測定采用硫酸苯酚法[5]，硒含量測定采用雙道原子熒光法[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

根據(jù)苯酚-硫酸法，得到的葡萄糖標準曲線方程為：Y=17.31X-0.0149，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9959。

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 不同超聲波處理時間對板栗硒多糖提取率的影響

超聲波處理不同的時間(其它實驗因素：溫度60℃、浸提時間0.5 h、料液比為1∶30)，測定的板栗硒多糖的提取率結(jié)果如圖1所示。

圖1 超聲波處理時間對提取率的影響

由圖1可知，不同超聲波處理條件下，板栗硒多糖的提取率有所不同，當超聲波處理時間為15min時，硒多糖的提取率最高，最佳超聲波處理時間為15min。

2.2.2 不同溫度處理對板栗硒多糖提取率的影響

不同溫度下水浴浸提(其它實驗因素：超聲波處理10min、浸提時間0.5h、料液比為1∶30)，測定的板栗硒多糖的提取率結(jié)果如圖2所示。

圖2 溫度對提取率的影響

由圖2可以看出，水浴不同浸提溫度下，得到的板栗硒多糖的提取率也不同，且當溫度為50℃時，提取率最高，由上可知，最佳水提溫度為50℃。

2.2.3 不同料液比處理對板栗硒多糖含量的影響

不同料液比下浸提(其它實驗因素：超聲波處理10min、浸提時間0.5 h、水浴浸提溫度60℃)，測定的板栗硒多糖的提取率結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對提取率的影響

由圖3可以看出，不同料液比條件下，得到的板栗硒多糖的提取率也有所不同，且當料液比為1∶15時，硒多糖提取率最高，可知最佳料液比為1∶15。

2.2.4 不同浸提時間處理對板栗硒多糖提取率的影響

不同的浸提時間(其它實驗因素：超聲波處理10min、料液比：1∶30、水浴浸提溫度60℃)，測定的板栗硒多糖的提取率結(jié)果如圖4所示。

圖4 浸提時間對提取率的影響

由圖4可看出，不同水提時間下，所得板栗硒多糖的提取率也不同，當浸提時間為1.5 h時，提取率最高，可知最佳水浴浸提時間為1.5 h。

2.3 正交實驗設(shè)計的結(jié)果與分析

正交實驗提取分析的數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗結(jié)果

表2為正交實驗分析結(jié)果，有表可知，F(xiàn)A=5.160，F(xiàn)B=3.838，F(xiàn)C=0.536，F(xiàn)D=3.664，因素A和B和D三因素顯著性水平>0.05，而C的的顯著水平<0.05，且顯著性大小為A>B>D>C,這表明不同的超聲波處理(A)和不同的溫度處理(B)和處理時間(D)不同對實驗結(jié)果有顯著影響，而料液比(C)對實驗結(jié)果影響不顯著。

表3 主體間效應(yīng)的檢驗

由正交試驗方差分析結(jié)果可知，最佳正交試驗組合為A3B3D1C2、即最佳提取條件為超聲波處理15min、溫度為60℃、料液比為1∶15、提取時間為1 h，并且在最佳提取條件下，吸光度值為0.454，根據(jù)葡萄糖標準曲線計算出提取率為1.35%。

2.4 硒含量測定的結(jié)果與分析

表4 硒含量測定結(jié)果

由表4數(shù)據(jù)結(jié)果分析可知，板栗中和提取分離后的多糖中都含有一定量的硒，由于板栗比較常見，營養(yǎng)價值高，所以研究富硒板栗對人體健康保健等方面具有重大的意義。

3 結(jié)果與討論

本實驗采用恩施市沙地鄉(xiāng)富硒板栗為實驗原料,通過正交試驗對板栗中硒多糖的最佳提取工藝條件進行了研究，得到板栗多糖的最佳提取工藝條件為：超聲15min、溫度60℃、料液比1∶15、浸提時間為1 h，在最佳的提取工藝下，板栗多糖的提取率為1.35%；用雙道原子熒光法對硒含量進行了測定，并且測得板栗樣品的硒含量為2.715μg/g ，提純多糖硒含量為0.429μg/g。由于板栗中多糖的含量相對于淀粉等物質(zhì)來說,多糖含量相對較少，該實驗板栗多糖的提取率僅為1.35%，說明板栗多糖含量不高，提取率偏低。但由于板栗比較常見，物美價廉,且恩施被譽為是“世界硒都”，所以用恩施市沙地鄉(xiāng)富硒板栗為實驗原料，研究富硒板栗對人體健康保健等方面具有重大的意義。 通過對板栗硒多糖的提取分離及硒含量等方面的研究，為硒多糖的近一步研究提供了理論和實踐基礎(chǔ)，本實驗也有很多不足的地方，會在以后的學(xué)習(xí)生活中不斷的學(xué)習(xí)不斷的總結(jié)。

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