用于超低過氧化物檢測的抗重金屬干擾穩(wěn)定性生物試紙

劉博穎

福建省泉州實(shí)驗(yàn)中學(xué) 福建泉州 362000

過氧化物作為一種重要且常見的氧化劑，目前已經(jīng)被廣泛用于食品、制藥、醫(yī)學(xué)工業(yè)和環(huán)境分析等領(lǐng)域。（1）但是如果生物體長期接觸過氧化物，即使是超低濃度的過氧化物，在長期積累過程中，會造成嚴(yán)重的后果，比如導(dǎo)致基因突變、老年癡呆、動(dòng)脈硬化等等。（2）因此我們需要在日常生活中對其進(jìn)行檢測。目前市場上已經(jīng)開發(fā)的過氧化物檢測方法主要是采用分光光度法、碘化鉀試紙法、滴定法和色譜法等，皆有一定的缺點(diǎn)，如價(jià)格昂貴、檢測能力差、操作復(fù)雜和靈敏度低等。（3）因此，我們希望開發(fā)一種簡便、精確、成本低的檢測方法。本文設(shè)計(jì)了一種新型的抗重金屬干擾穩(wěn)定性生物試紙，采用辣根過氧化物酶作為催化劑，具備反應(yīng)迅速的優(yōu)點(diǎn)。（4）考慮到含有過氧化物的溶液中常有重金屬離子的存在，我們通過設(shè)計(jì)試紙結(jié)構(gòu)，可將重金屬離子在進(jìn)入酶催化區(qū)域前螯合分離，確保了酶的催化活性。同時(shí)考慮到商業(yè)應(yīng)用，酶在長期保存中穩(wěn)定性較差，因此我們加入多羥基小分子糖對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行保護(hù)，提高其保質(zhì)期。（5）此試紙性價(jià)比高，具有較強(qiáng)的市場競爭力[1]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑

辣根過氧化物酶（HRP），2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS），海藻糖均購自Sigma公司。其它均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

配置10mL的1mg/mL的HRP溶液，加入10mg，20mg，30mg海藻糖，得到海藻糖酶溶液。制備20mM的ABTS溶液，將其和含有海藻糖的酶溶液按1：10的比例混合，隨后取1mL均勻分布于試紙酶反應(yīng)區(qū)域，自然風(fēng)干。取5mg/mLEDTA溶液1mL，均勻分布于螯合區(qū)域，自然風(fēng)干。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗干擾分區(qū)試紙的設(shè)計(jì)

試紙的設(shè)計(jì)為長方形，尺寸為寬2cm，長8cm，由上到下為酶反應(yīng)區(qū)、層析區(qū)、螯合區(qū)、加樣區(qū)。分別為2cm*2cm。酶反應(yīng)區(qū)添加有HRP、ABTS和不同濃度的海藻糖，在過氧化物的存在下，HRP將ABTS催化氧化生成綠色的ABTS·+，而顏色深度和過氧化物濃度成正比，因此通過和標(biāo)準(zhǔn)色的對比，即可知道過氧化物的濃度。螯合區(qū)均勻分布有EDTA，可通過螯合作用將重金屬截留在該區(qū)域。保護(hù)了酶不受重金屬的干擾。兩者之間的層析區(qū)，是進(jìn)一步將酶和重金屬隔離開，避免螯合物進(jìn)入酶反應(yīng)區(qū)域。

2.2 試紙測試結(jié)果討論

在制備了加入小分子糖保護(hù)劑的抗重金屬干擾的試紙后，首先對其檢測能力進(jìn)行測試。這里我們采用過氧化氫作為典型過氧化物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如下圖1所示，圖1a為檢測混合有1mg/mL氯化鎘和1mg/mL氯化鉛的低濃度過氧化氫溶液（0.002%）的結(jié)果，圖1b為制備的標(biāo)準(zhǔn)對比色。可看到1a中的試紙檢測結(jié)果與圖1b中的標(biāo)準(zhǔn)色對比，顏色介于0.0015%與0.003%之間，結(jié)果符合要求。而常規(guī)下，出現(xiàn)如此高濃度的重金屬離子，酶會立即失活。由此可見，螯合區(qū)隔絕了重金屬離子和酶的相互接觸，保護(hù)了酶的活性。

圖1 （a）抗重金屬干擾分區(qū)試紙；（b）標(biāo)準(zhǔn)色對比

隨后為了驗(yàn)證海藻糖對酶的保護(hù)，我們將含有不同濃度海藻糖的試紙放置在室溫的環(huán)境中，保持3個(gè)月后，進(jìn)行活性的檢測?；钚詳?shù)據(jù)如圖2?？梢园l(fā)現(xiàn)，在濃度達(dá)到2mg/mL以上之時(shí)，在保存3個(gè)月后，可以實(shí)現(xiàn)95%以上的活性保留。再加大糖的濃度意義不大，考慮到性價(jià)比，我們可以優(yōu)先選擇2mg/mL的海藻糖。保質(zhì)期的提升，為該試紙的市場化提高了競爭能力。

圖2 穩(wěn)定性測試

3 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一種抗鎘離子和鉛離子干擾的具備高穩(wěn)定性的酶檢測試紙，并通過顯色反應(yīng)證明了其對低濃度過氧化氫的檢測能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，螯合區(qū)域的存在可以將重金屬離子剝離，保護(hù)酶的活性。同時(shí)我們也加入了不同含量的海藻糖進(jìn)行穩(wěn)定性的測試，結(jié)果證明含有2mg/mL以上海藻糖的酶試紙，穩(wěn)定性出色，證明了其市場化能力。