大鼠肺缺血再灌注損傷中阿米洛利的作用機(jī)制分析

劉偉存

[摘要]目的 探討大鼠肺缺血再灌注損傷中阿米洛利的作用機(jī)制。方法 選擇雄性實驗大鼠72只作為研究對象，隨機(jī)分成三組，每組24只，分別為IR組（缺血再灌注）、假手術(shù)組（C組）、阿米洛利組（A組），分別在缺血45 min、再灌注60 min和120 min 3個不同時點將各組實驗大鼠麻醉處死后取血漿和右肺組織，并對其進(jìn)行檢測。結(jié)果 IR組再灌注60、120 min時，丙二醛（MDA）、凋亡指數(shù)（AI）較假手術(shù)組均有明顯升高，阿米洛利組在給予藥物后，MDA、AI與IR組比較均有明顯降低（P<0.05）。與假手術(shù)組相比，IR組各個時點的肺組織濕/干質(zhì)量比（W/D）和髓過氧化物酶（MPO）活性均顯著增高（P<0.05），而阿米洛利給藥后肺組織W/D和MPO活性則顯著降低。結(jié)論 阿米洛利對肺缺血再灌注損傷具有很強(qiáng)的保護(hù)作用，這可能是通過減少鈣離子，從而清除體內(nèi)過量的氧自由基，達(dá)成抑制中性粒細(xì)胞浸潤和減少細(xì)胞凋亡的目的。

[關(guān)鍵詞]肺缺血再灌注損傷；阿米洛利；氧自由基

[中圖分類號] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）3（b）-0021-03

Analysis on mechanism of effects of Amiloride on rats with pulmonary ischemia reperfusion injury

LIU Wei-cun

Department of Respiration，Kailuan General Hospital of Tangshan City in Hebei Province，Tangshan 063000，China

[Abstract]Objective To explore the mechanism of effects of Amiloride on rats with pulmonary ischemia reperfusion injury.Methods Seventy-two experimental male rats were selected and randomly divided into the IR group （the ischemia reperfusion group），the sham operation group （group C） and the Amiloride group （group A），24 rats in each group.After 45 min ischemia，60 min reperfusion and 120 min，rats in each group were anesthetized and killed，then plasma and right lung tissues were taken and detected.Results At 60 and 120 min reperfusion，malondialdehyde （MDA），apoptosis index （AI） in the IR group were significantly higher than those in the sham operation group.The Amiloride group was given drugs，MDA and AI were significantly lower，compared with the IR group （P<0.05）.Compared with the sham operation group，the lung wet/dry weight ratio （W/D） and myeloperoxidase （MPO） activity in the IR group at each time point were significantly increased （P<0.05），while Amiloride after administration，the W/D in lung tissue and MPO activity decreased significantly.Conclusion Amiloride on lung ischemia reperfusion injury has a strong protective effect，this may be by reducing calcium ion，so as to remove the body of excess oxygen free radicals and inhibition of neutrophil infiltration and reduce cell apoptosis of purpose.

[Key words]Lung ischemia-reperfusion injury；Amiloride；Oxygen free radicals

近幾年，由于藥物和醫(yī)術(shù)的精進(jìn)使得患者心肺復(fù)蘇、肺栓塞和心臟轉(zhuǎn)流等都得到了改善，但是仍然有影響因素，其中最重要的就是肺缺血再灌注損傷[1]。阿米洛利是一種交換抑制劑，其主要是交換Na+/H+，國外很多文獻(xiàn)中都提到了交換劑在心肌缺血再灌注損傷中的作用，其主要作用就是能夠起到抗氧化和抗炎的作用，但在肺缺血再灌注損傷中是否有一定的保護(hù)作用目前沒有相關(guān)實驗和文獻(xiàn)的印證[2]。本研究對建立肺缺血再灌注大鼠進(jìn)行模型建造，旨在研究阿米洛利在肺缺血再灌注方面的相關(guān)作用。

1材料與方法

1.1實驗藥品與試劑

阿米洛利粉劑購自美國Sigma公司；肝素鈉注射液購自上海生物化學(xué)試劑有限公司；丙二醛（MDA）試劑盒和髓過氧化物酶（MPO）試劑盒購自南京生物工程研究所；戊巴比妥鈉注射液購自上海試劑三廠；凋亡檢測試劑盒購自北京生物有限技術(shù)公司。

1.2實驗動物與分組

72只健康雄性SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠由華北理工大學(xué)實驗動物中心提供，體重180～220 g，動物生產(chǎn)合格證號為SCXK冀20061026-0001795。給予充分飼料和飲水1周后進(jìn)行實驗。SD大鼠隨機(jī)分為三組，每組24只。IR組（缺血再灌注）：先開胸游離右肺門，然后進(jìn)行夾閉阻隔，之后繼續(xù)完成灌注。假手術(shù)組（C組）：先開胸游離右肺門后，但是對其不進(jìn)行夾閉阻隔。阿米洛利組（A組）：使用5 mg/（kg·d）的阿米洛利連續(xù)灌胃，時間為1周，1周之后進(jìn)行手術(shù)，剩余操作和IR組一致，無區(qū)別[3]。IR組和C組在相同時間點內(nèi)注入等量的生理鹽水。

1.3大鼠模型的建立

選擇健康的SD大鼠（由華北理工大學(xué)實驗動物中心提供），腹腔注射3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）對其進(jìn)行麻醉。仰臥位固定，將器官切開后進(jìn)行插管，然后連接動物呼吸機(jī)，幫助大鼠通氣，動物呼吸機(jī)的設(shè)置要求：呼吸頻率60次/min，在經(jīng)胸骨右邊第3～5肋之間開胸，游離右肺門，穿入手術(shù)線，等待5 min，然后夾閉45 min，之后建成模型[4]。

1.4標(biāo)本采集及檢測

缺血45 min及再灌注60 min和120 min后收集全血，3000 r/min離心10 min取上清，采集新鮮右肺組織，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1血清MDA含量測定 腹主動脈抽血3 ml，3000 r/min離心10 min，分離血清用硫代巴比妥酸（thiobarbituric aci，TBAd）法對血清中的MDA進(jìn)行檢測。

1.4.2肺組織MPO測定 獲取右肺上葉相同部位肺組織1 g，取得之后制備成勻漿，最后把制備好的勻漿進(jìn)行離心，離心之后取上清液用比色法測MPO。

1.4.3對肺組織濕/干重比值（W/D）進(jìn)行測定 獲取大鼠1 g右肺中葉組織，使用分析天平進(jìn)行稱量，稱量得到的質(zhì)量稱為濕質(zhì)量，然后將其放在70℃電熱恒溫進(jìn)行干燥，干燥之后得到的質(zhì)量稱為干質(zhì)量，其中濕質(zhì)量和干質(zhì)量的比例是W/D[5]。

1.4.4肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）的檢測 獲取一小塊右肺中葉進(jìn)行固定，固定液選用10%的甲醛溶液，固定之后將其使用常規(guī)石蠟進(jìn)行包埋，對大鼠右側(cè)肺中葉的凋亡細(xì)胞進(jìn)行定量檢測。對細(xì)胞進(jìn)行染色，細(xì)胞核染色之后呈現(xiàn)棕黃色，也是陽性細(xì)胞，除去細(xì)胞核之后，還會有部分細(xì)胞質(zhì)也會著色顯示為黃色[6]。一些細(xì)胞質(zhì)由于細(xì)胞核DNA碎片漏出導(dǎo)致出現(xiàn)陽性著染。對切片進(jìn)行觀察，觀察使用工具是切片光鏡。

1.4.5病理檢查 獲取一定量的組織塊，以10%的甲醛溶液進(jìn)行固定后再進(jìn)行包埋，切片，HE染色，最后在光鏡下觀察切片的變化。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1血漿MDA和肺AI在不同時點的變化情況

各組不同灌注時間點的MDA和AI值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；各組缺血45 min時的MDA、AI比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。IR組灌注60、120 min時的MDA、AI明顯提升，且顯著高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2肺組織W/D和MPO活性在不同時點的變化情況

各組內(nèi)不同灌注時間點上的肺組織W/D和MPO活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；在不同灌注時點，IR組與A組的肺組織W/D和MPO活性顯著高于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且IR組的肺組織W/D和MPO活性顯著高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3肺組織經(jīng)病理學(xué)驗證情況分析

正常對照組的肺組織形態(tài)無任何明顯變化，然后肺泡腔中會變得壁薄，無充血、水腫等情況。缺血再灌注發(fā)生45 min之后，就會出現(xiàn)一些癥狀，主要是血管出現(xiàn)充血，血管出現(xiàn)充血之后，肺泡之間會產(chǎn)生炎性細(xì)胞，炎性細(xì)胞增多，細(xì)胞的損傷程度也會加重。

3討論

肺缺血再灌注損傷的病理原因非常復(fù)雜，目前尚不明確，研究顯示，氧自由基增多，鈣離子量也變多，炎癥細(xì)胞也增多，這些物質(zhì)增多之后就會聚集在一起，然后造成細(xì)胞凋亡，這些在肺缺血再灌注損傷的發(fā)展過程中起著非常關(guān)鍵的作用[7]，因此部分學(xué)者認(rèn)為可以主要在這幾個方面進(jìn)行干預(yù)，通過這些干預(yù)措施實驗對肺缺血再灌注損傷的保護(hù)[8]。

器官缺血出現(xiàn)再灌注損傷的重要因素是出現(xiàn)氧自由基，氧自由基可以分解患者體內(nèi)細(xì)胞間質(zhì)的酶和膠原，使得組織器官受到極大損傷，MDA是氧自由基在攻擊其他組織時產(chǎn)生的產(chǎn)物[9]，其含量可以直接決定到體內(nèi)氧化負(fù)電荷的大小，是判斷產(chǎn)生氧自由基和組織受到損傷的主要指標(biāo)，在實驗過程中也能觀察到。在IR組中，灌注時間越長，LVIDA值越大，提示肺缺血再灌注損傷出現(xiàn)在體內(nèi)能夠破壞氧自由基，使得氧自由基平衡徹底被破壞，增加氧自由基，誘發(fā)肺水腫和出血癥。注射阿米洛利之后，MDA雖然也增多，但是增加的幅度沒有IR組大，其降低效果也比較明顯，提示阿米洛利具有很強(qiáng)的抗氧化能力，抑制自由基產(chǎn)生，減少肺缺血再灌注損傷。

肺缺血再灌注損傷情況的出現(xiàn)和繼續(xù)發(fā)展與中性粒細(xì)胞的激活和聚集有著非常緊密的聯(lián)系[10]。出現(xiàn)這種情況之后，經(jīng)過呼吸作用釋放出極多的氧自由基和蛋白水解酶，出現(xiàn)的蛋白水解酶會損傷肺血管組織和肺血管組織周圍的器官，使得肺泡中的上皮細(xì)胞受到損傷。MPO是一種特異性酶，而且還是一種中性粒細(xì)胞，其含量可以用中性粒細(xì)胞來測定。實驗結(jié)果顯示，注射阿米洛利之后，MPO量明顯降低，提示注射阿米洛利能夠有效減弱肺缺血再灌注損傷時中性粒細(xì)胞的聚集情況。

文獻(xiàn)顯示，細(xì)胞凋亡情況主要和缺血灌注損傷有關(guān)系，當(dāng)處于肺缺血再灌注損傷情況下，患者體內(nèi)會快速出現(xiàn)大量的氧自由基和鈣離子，這兩種物質(zhì)增加，細(xì)胞凋亡情況就會加重[11]。本研究結(jié)果顯示，在缺血情況出現(xiàn)多于30 min時，IR組與C組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；隨著灌注時間的延長，IR組內(nèi)AI會快速增長，2 h達(dá)到最高值，這一結(jié)果和國內(nèi)相關(guān)報道的內(nèi)容一致。本研究結(jié)果還顯示，A組也升高，但是和IR組比較，數(shù)值還是比較低，提示阿米洛利能夠抑制肺缺血再灌注損傷，減輕細(xì)胞凋亡情況，減少患者損傷情況。

Na+/H+交換體屬于一種抑制交換體，也稱為NHE（Na+/H+ exchanger），在缺血灌注中體現(xiàn)出了陽離子的作用，表明在患者處于一種缺血狀態(tài)時，患者體內(nèi)的酸中毒情況會逐漸加重，隨機(jī)NHE也會被激活[12]。但是在血液轉(zhuǎn)運過程中卻因為細(xì)胞出現(xiàn)酸中毒情況而被抑制發(fā)展，當(dāng)再次灌注之后，患者體內(nèi)的血流會恢復(fù)正常，細(xì)胞中毒情況也會得到改善，糾正細(xì)胞內(nèi)酸中毒，而且還能聚集鈉離子[13]。這是因為ATP量開始減少，Na泵不能排除鈉離子，使得Na+/Ca2+交換體從反方向開始轉(zhuǎn)出，轉(zhuǎn)出鈉離子的同時還會攝入鈣離子，使得鈣超量，由此造成了氧自由基增多、出現(xiàn)多種炎癥反應(yīng)和患者體內(nèi)細(xì)胞凋亡情況，從而加重了患者的病癥。阿米洛利是一種抑制劑，屬于Na+/H+交換抑制劑，主要作用是推測患者體內(nèi)的氧自由基是否得到抑制，患者細(xì)胞凋亡情況是否得到改善[14]。

目前評價肺水含量和微血管損傷的治療是肺組織W/D，本研究主要是對IR組灌入W/D，灌入之后其性能還是非常高，提示阿米洛利對于干預(yù)患者體內(nèi)的病癥是非常有作用的；同時，也在檢查的切片中觀察到患者注射阿米洛利之后肺水腫和體內(nèi)炎癥的變化情況，和IR組比較，患者的癥狀得到了明顯的改善，提示阿米洛利的作用是清除患者體內(nèi)的氧自由基，從而從根本減少患者體內(nèi)的中性粒細(xì)胞[15]。

綜上所述，阿米洛利對肺缺血再灌注損傷有著很強(qiáng)的保護(hù)作用，這可能與其抑制作用有關(guān)，由此來減少鈣離子，繼而減少人體內(nèi)分解出的氧自由基，實現(xiàn)抑制患者體內(nèi)中性顆粒細(xì)胞的浸潤和減少人體內(nèi)細(xì)胞的凋亡。

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（收稿日期：2017-12-15 本文編輯：祁海文）