MUC2和TFF3在結(jié)腸腺瘤和腺癌組織的表達(dá)及意義

朱 蓉，劉振民，邱思芳，張 泉，趙 逵

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

結(jié)腸癌的發(fā)病率及死亡率居高不下，且發(fā)病呈年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅人類的身體健康。但有關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制，至今尚未闡明，研究者們也持有不同的觀點(diǎn)，其中最經(jīng)典的即是“正常粘膜—結(jié)腸腺瘤—結(jié)腸腺癌”途徑。近來，隨著腫瘤干細(xì)胞理論的提出，許多學(xué)者認(rèn)為，歸根結(jié)底，結(jié)腸癌干細(xì)胞才是結(jié)腸癌的最終起源和根本[1-2]。當(dāng)結(jié)腸癌干細(xì)胞分化減少或是異常分化時(shí)都將促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生和進(jìn)展。已有研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌的發(fā)生進(jìn)展過程中，杯狀細(xì)胞的分化改變慣穿了始終[3-4]，粘蛋白 2( Mucin2，MUC2)和腸三葉因子3(Trefoil Factor Family3，TFF3)作為腸杯狀細(xì)胞重要分化標(biāo)志物，在結(jié)腸腺瘤和腺癌中表達(dá)如何，以及與結(jié)腸癌的分化、轉(zhuǎn)移等臨床病理特征是否存在關(guān)聯(lián)，二者是否可以作為結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移判斷的預(yù)測因子，成為了本研究的主旨內(nèi)容。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2015年1月至2016年12月經(jīng)外科手術(shù)切除的結(jié)腸腺癌標(biāo)本50例和電子結(jié)腸鏡活檢鉗取的腺瘤標(biāo)本15例以及正常結(jié)腸標(biāo)本10例，均經(jīng)病理證實(shí)。結(jié)腸腺癌患者的臨床特點(diǎn)為：男26例，女24例；年齡27～85歲，中位63歲， 60歲及以上者27例，小于60歲者23例；有淋巴轉(zhuǎn)移者31例，無淋巴轉(zhuǎn)移者19例；伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者12例，不伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者38例；腺癌高分化者14例，中分化者27例，低分化者9例；腺癌TNM分期T1+T2期者9例，T3+T4期者41例；腺癌發(fā)生于左半結(jié)腸者25例，右半結(jié)腸者25例。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：① 腫瘤原發(fā)于結(jié)腸；②結(jié)腸癌患者術(shù)前未經(jīng)任何放化療及綜合治療等；③完整的臨床資料及隨訪記錄。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其它部位的腫瘤發(fā)生結(jié)腸轉(zhuǎn)移者；②結(jié)腸黏液腺癌及印戒細(xì)胞癌；③ 術(shù)前已進(jìn)行放化療及綜合治療等；④ 臨床資料及隨訪不完整者。

1.3 方法 采用免疫組織化學(xué)染色法(SP法)檢測MUC2和TFF3在各組織標(biāo)本的表達(dá)。標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，并送至病理科進(jìn)行石蠟包埋。組織切片(3 μm厚度連續(xù)切片)、烤片、脫蠟脫水、3% H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶、抗原修復(fù)、山羊血清封閉、加一抗(兔抗人MUC2單克隆抗體 1∶200，兔抗人TFF3單克隆抗體 1∶500)、4 ℃過夜、加二抗(抗兔二抗1∶1 000) 、洗滌、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、分化、脫水，干燥、中性樹膠封片、觀察照相。染色判斷：顯微鏡200和400倍放大下分別隨機(jī)選取5個(gè)視野，根據(jù)組織細(xì)胞的染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞數(shù)進(jìn)行綜合評分[5]：①染色強(qiáng)度評分：無染色，陰性，得0分；淺棕色，弱陽性，得1分；棕色無背景著色或深棕色伴有背景著色，中等陽性，得2分；深棕色不伴背景著色，強(qiáng)陽性，得3分；②陽性染色細(xì)胞數(shù)評分：無陽性染色細(xì)胞，得0分；陽性染色細(xì)胞數(shù)≤25%，得1分；25%<陽性染色細(xì)胞數(shù)<50%，得2分；陽性染色細(xì)胞數(shù)≥50%，得3分。兩者相乘即最終評分：0分，為陰性(記0分)；1～2分，為弱陽性(記1分)；3～4分，為中等陽性(記2分)；6～9分，為強(qiáng)陽性(記為3分)。最終結(jié)果：記0～1分判定陰性表達(dá)：記2～3分判定陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS18.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，均為計(jì)數(shù)資料，以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)，與臨床病理特征的相關(guān)分析采用Spearman 相關(guān)分析法。P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MUC2在正常結(jié)腸、結(jié)腸腺瘤及腺癌組織的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示，杯狀細(xì)胞標(biāo)志物MUC2陽性表達(dá)主要在細(xì)胞漿內(nèi)，以核周及核上部尤為顯著。正常結(jié)腸組織呈強(qiáng)陽性表達(dá)、表達(dá)較局限，結(jié)腸腺瘤呈中等陽性，而結(jié)腸腺癌呈弱陽性、表達(dá)向腸腔彌散(見圖1)。

2.2 TFF3在正常結(jié)腸、結(jié)腸腺瘤及腺癌組織的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示，杯狀細(xì)胞標(biāo)志物TFF3陽性表達(dá)也主要位于細(xì)胞漿內(nèi)，以核周及核上部明顯。正常結(jié)腸組織呈強(qiáng)陽性表達(dá)、表達(dá)局限于核周，結(jié)腸腺瘤呈中等陽性，而結(jié)腸腺癌呈弱陽性、表達(dá)較為彌漫(見圖2)。

A：正常結(jié)腸(×200);B:結(jié)腸腺瘤(×200);C:結(jié)腸腺癌(×200);D：正常結(jié)腸(×400);E:結(jié)腸腺瘤(×400);F:結(jié)腸腺癌(×400)。圖1 MUC2在正常結(jié)腸、結(jié)腸腺瘤及腺癌組織中的表達(dá)

A：正常結(jié)腸(×200);B:結(jié)腸腺瘤(×200);C:結(jié)腸腺癌(×200);D：正常結(jié)腸(×400);E:結(jié)腸腺瘤(×400);F:結(jié)腸腺癌(×400)。圖2 TFF3在正常結(jié)腸、結(jié)腸腺瘤及腺癌組織中的表達(dá)

2.3 MUC2和TFF3在正常結(jié)腸、結(jié)腸腺瘤及腺癌組織中的表達(dá)趨勢 MUC2在正常結(jié)腸、結(jié)腸腺瘤及腺癌組織中的陽性表達(dá)率分別為100%、73.3%、38.0%，TFF3的陽性表達(dá)率分別為100%、66.6%、44.0%，二者表達(dá)均呈逐漸下降趨勢，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1～2和表1)。

表1正常結(jié)腸、結(jié)腸腺瘤及腺癌組織中MUC2和TFF3的表達(dá)

檢測指標(biāo)陽性表達(dá)率(%)正常結(jié)腸組結(jié)腸腺瘤組結(jié)腸腺癌組χ2PMUC2100(10/10)73.3(11/15)38.0(19/50)15.884<0.001TFF3100(10/10)66.6(10/15)44.0(22/50)11.4720.003

2.4 MUC2和TFF3的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果示，MUC2和TFF3的表達(dá)均與結(jié)腸癌患者年齡、性別、癌發(fā)生部位及分化程度無關(guān)(P>0.05)，而與結(jié)腸癌的TNM分期、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。但有所不同的是MUC2與結(jié)腸癌TNM分期、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(χ2值分別為9.574、8.233、4.358，P值分別為0.001、0.005、0.014)，而TFF3與之呈正相關(guān)(χ2值分別為3.328、3.889、6.158，P值分別為0.030、0.045、0.016)，見表2。

表2 MUC2和TFF3的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)

臨床病理特征例數(shù)MUC2陽性數(shù)χ2PTFF3陽性數(shù)χ2P性別男女262411180.4270.35912100.1020.487年齡<60歲≥60歲23279100.0230.55511110.2530.414部位左半結(jié)腸右半結(jié)腸25251090.0850.50012100.3250.388分期T1+T2T3+T49418119.5740.0011213.3280.030分化程度高分化中分化低分化1427961030.2340.89061150.6120.737淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無31197128.2330.0051753.8890.045遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有無12381184.3580.0149136.1580.016

3 討論

結(jié)腸癌是人類發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的身體健康，尤其是晚期轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)，一直是難以解決的瓶頸問題。有關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，存在多種觀點(diǎn)，其中最經(jīng)典的即是“正常粘膜—結(jié)腸腺瘤—結(jié)腸腺癌”途徑。但近來科學(xué)研究者們提出，歸根結(jié)底，結(jié)腸癌干細(xì)胞才是結(jié)腸癌最終的起源和根本。存在于結(jié)腸癌的這一小群干細(xì)胞，具有“干性”特征，它們不僅能自我更新，失控性增殖，還具有多向分化潛能[1]。當(dāng)分化減少或是異常分化時(shí)都將促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生和進(jìn)展。

MUC2作為腸杯狀細(xì)胞的重要分化標(biāo)志物，是一種高分子量富含寡糖鏈的分泌型粘蛋白[6]，是腸道黏液保護(hù)的主要成分，正常情況下100%表達(dá)于腸道粘膜。已有研究表明MUC2的減少或缺失參與結(jié)腸癌發(fā)生進(jìn)展，且可能是結(jié)腸腺瘤癌變的一個(gè)重要標(biāo)志物[4]。Velcich A和Selamawit Tadesse等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)MUC2基因敲除小鼠腸道代謝和炎癥發(fā)生改變，最終導(dǎo)致腸道腫瘤的發(fā)生。本研究免疫組化結(jié)果顯示，與正常結(jié)腸組織相比，MUC2在結(jié)腸腺瘤中表達(dá)下調(diào)，在腺癌中更進(jìn)一步下調(diào)，說明MUC2的表達(dá)下調(diào)在“正常結(jié)腸—結(jié)腸腺瘤—腺癌”這一經(jīng)典機(jī)制中可能起著重要的作用，其表達(dá)下調(diào)可能預(yù)測結(jié)腸癌的發(fā)生，此研究結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道相符[9-10]。

不僅如此，目前已有多項(xiàng)研究表明，MUC2與結(jié)腸癌的臨床病理特征存在一定聯(lián)系：馬曉娟等[4]研究發(fā)現(xiàn)，MUC2 表達(dá)情況與結(jié)腸癌Dukes分期，淋巴和肝轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，而與患者年齡大小、性別、腫瘤分化和部位無關(guān)。左曉旭等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MUC2 表達(dá)與結(jié)腸癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織類型相關(guān)，而與性別、腫瘤大小、血管和淋巴管侵襲無關(guān)。本研究結(jié)果也表明，MUC2表達(dá)與結(jié)腸癌患者年齡、性別、癌發(fā)生部位及分化程度無關(guān)，而與結(jié)腸癌TNM分期、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。

TFF3也是腸杯狀細(xì)胞分泌的重要分化標(biāo)志物，是一種內(nèi)源性多肽，正常情況下參與腸道粘膜保護(hù)和損傷修復(fù)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，TFF3在多種腫瘤(包括結(jié)腸癌[11]、胃癌[12]、前列腺癌[13]、甲狀腺癌[14]等)表達(dá)異常。它作為分化標(biāo)志物表現(xiàn)為腫瘤早期抑癌作用[15]，并且其表達(dá)下調(diào)與腸上皮化生和不典型增生具有相關(guān)性[16]。同時(shí)，TFF3也存在潛在的促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展轉(zhuǎn)移的作用：李鳳玉等[10]研究發(fā)現(xiàn)TFF3在結(jié)腸腺瘤和結(jié)直腸癌中表達(dá)陽性率均較正常減少，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，而與患者年齡、性別、腫瘤大體類型和大小、分化程度以及病理類型等無關(guān)。本研究結(jié)果顯示，TFF3在結(jié)腸腺瘤和腺癌組織表達(dá)減少，其表達(dá)與結(jié)腸癌患者年齡、性別、癌發(fā)生部位及分化程度無關(guān)，而與結(jié)腸癌TNM分期、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

MUC2和TFF3均在結(jié)腸腺瘤、腺癌中表達(dá)逐漸下調(diào)，且二者均是腸杯狀細(xì)胞分化標(biāo)志物，說明在“正常結(jié)腸——腺瘤——癌變”的過程中，向正常的腸杯狀細(xì)胞分化減少，二者的聯(lián)合檢測可能更有助于對結(jié)腸癌變的早期預(yù)測。不僅如此，二者與結(jié)腸癌的TNM分期、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，由此可能作為判斷結(jié)腸癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的預(yù)測因子。但是，二者表達(dá)下調(diào)的具體調(diào)控機(jī)制如何，二者具體在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機(jī)制又如何，尚需更加深入的研究。

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