金釵石斛在SD大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

杜藝玫，張一新，凌 蕾，劉 浩，曾 瑤，李 炯，何芋岐，魯艷柳，周旭美

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就列為上品的名貴補(bǔ)益中藥石斛，因其具有滋陰清熱、益胃生津、潤(rùn)肺止咳、明目強(qiáng)身等作用，市場(chǎng)需求日益擴(kuò)大，對(duì)其進(jìn)一步的開發(fā)和利用亟待開展。在2015版中國(guó)藥典中明確規(guī)定，石斛的藥用植物來源之一是金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)，而其所含生物堿正是其主要的活性成分[1]，具有降血糖[2]、抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、抗老年癡呆[5- 6]、抑制細(xì)胞凋亡[7]、抗白內(nèi)障[8]、解熱、止痛、解毒[9]等現(xiàn)代藥理作用。金釵石斛總生物堿主要為倍半萜類生物堿，目前分離得到石斛堿、石斛氨堿、石斛酮堿等總計(jì)14種[10]。其中，石斛堿(dendrobine，C16H25O2N)是金釵石斛總生物堿中最主要的特征性成分[6,11-12]，在課題組的前期研究中也發(fā)現(xiàn)，石斛堿占金釵石斛總生物堿含量的92%以上[13]，結(jié)構(gòu)如圖1。目前對(duì)金釵石斛研究報(bào)道主要集中在藥效學(xué)方面，而較少研究其藥物代謝動(dòng)力學(xué)。因此，本文將以石斛堿為指標(biāo)，在課題組前期體外代謝研究的基礎(chǔ)上[14]，采用UPLC-MS建立能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)大鼠血漿中石斛堿含量的方法，首次探討金釵石斛細(xì)粉灌胃給藥后在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的特征，為其進(jìn)一步研究、開發(fā)提供參考，并為臨床給藥方案提供依據(jù)。

圖1 石斛堿結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 儀器 Thermo Scientific Q Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，Thermo Ultrmate 3000 超高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Fisher公司)，Genius 1022液氮發(fā)生器(英國(guó)PEAK公司)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)，XS205電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，XW-80A漩渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，Microfuge 20R高速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)，STW-FT24制冰機(jī)(日本三洋公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康SPF級(jí)SD大鼠7只[生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK(渝)2012-0005]，由重慶第三軍醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重200～240 g，飼養(yǎng)溫度21～22 ℃，濕度56%～65%，明暗交替時(shí)間12/12 h。本實(shí)驗(yàn)符合遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 藥品與試劑 金釵石斛藥材(批號(hào)：ZCXT20160503)購(gòu)自貴州赤水市信天中藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司。取適量干燥藥材粉碎，至全部通過五號(hào)篩，且至少95%通過六號(hào)篩，即得細(xì)粉。精密稱取約0.25 g細(xì)粉，按照藥典石斛項(xiàng)下金釵石斛的提取方法[15]提取，參考前期實(shí)驗(yàn)研究方法[16]測(cè)定藥材中石斛堿的含量，按干燥品計(jì)算，含石斛堿0.40%。

石斛堿(批號(hào)：D990100)，購(gòu)自北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%。鹽酸偽麻黃堿(批號(hào)：171237-201208)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.9%。乙腈、甲醇、甲酸均為質(zhì)譜級(jí)，購(gòu)自Sigma-Aldrich化學(xué)制品有限公司。其它試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.4 方法

1.4.1 UPLC-MS的分析條件 色譜條件：采用Hypersil Gold C18(150 × 2.1 mm，1.9 μm)色譜柱分離；流動(dòng)相組成為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫條件為0～0.5 min，5% A；0.5～15 min，5%～95% A；15～17 min，95% A；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：采用HESI 離子化方式；霧化溫度為300 ℃，離子傳輸管溫度為350 ℃；鞘氣流速為35 arb，輔助氣流速為15 arb；噴霧電壓3.5 kV；m/z檢測(cè)范圍100～1 500；掃描模式為 Full Scan/正離子掃描；分辨率采用 MS Full Scan 70 000 FWHM。

1.4.2 對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)工作液的配制 精密稱取石斛堿對(duì)照品約15 mg，置于10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度線，混勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液，于4 ℃保存?zhèn)溆?。待用時(shí)精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，以乙腈稀釋，即得對(duì)照品工作液。

精密稱取鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品(IS)約10 mg，置于10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度線，混勻，即得內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于4 ℃保存?zhèn)溆?。待用時(shí)精密吸取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量，以乙腈稀釋，即得內(nèi)標(biāo)工作液，待用。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的配制及處理方法 實(shí)驗(yàn)當(dāng)日精密吸取空白血漿100 μL，加入不同濃度的石斛堿對(duì)照品工作液20 μL，渦旋30 s，再依次加入內(nèi)標(biāo)工作液20 μL和乙腈200 μL，渦旋30 s，即得含石斛堿質(zhì)量濃度分別為912.94、456.47、91.294、45.647、9.129 4 ng/mL和3.043 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品。13 000 rpm離心10 min，取上清50 μL進(jìn)行UPLC-MS分析。其中以質(zhì)量濃度912.94、91.294、9.129 4 ng/mL為高、中、低濃度質(zhì)控血漿樣品，質(zhì)量濃度3.043 ng/mL為定量下限(LLOQ)標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，均平行制備5份。

1.4.4 血漿樣品的處理方法 精密吸取血漿樣品100 μL，加入乙腈20 μL，渦旋30 s，再依次加入內(nèi)標(biāo)工作液20 μL和乙腈200 μL，渦旋30 s，13 000 rpm離心10 min，取上清50 μL置進(jìn)樣瓶中，待進(jìn)行UPLC-MS分析。

1.4.5 大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的研究 7只大鼠實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，實(shí)驗(yàn)12 h后進(jìn)食。按0.8 g/kg劑量灌胃給予金釵石斛細(xì)粉(0.5%CMC-Na助懸)，分別于給藥后0、2、6、10、15、20、30、40、60、90、120、180、240、480、720、1 440 min經(jīng)大鼠眼眶靜脈叢采血約0.2 mL，置肝素鈉化的離心管中，4 500 rpm離心15 min，分離血漿待測(cè)。采用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件DAS2.1，對(duì)大鼠灌胃給藥后的時(shí)間-血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行非房室模型(統(tǒng)計(jì)矩法)計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 方法的特異性 取7個(gè)不同來源的大鼠空白血漿，分別精密吸取空白血漿各100 μL，加入200 μL乙腈，渦旋30 s后，13 000 rpm離心10 min，各取上清50 μL供方法特異性的考察使用。取7個(gè)不同來源的大鼠給藥后的血漿，按1.4.4項(xiàng)下方法處理得到血漿樣品，以UPLC-MS進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。測(cè)定結(jié)果顯示,待測(cè)成分石斛堿和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為7.76、5.96 min，空白血漿在相應(yīng)時(shí)間處沒有出峰，表明該血漿處理方法及測(cè)定條件具有專屬性，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾石斛堿的準(zhǔn)確測(cè)定。

A：空白血漿；B：血漿樣品；1：石斛堿；2：內(nèi)標(biāo)。圖2 大鼠血漿中石斛堿和內(nèi)標(biāo)化合物的選擇離子圖

2.2 線性和定量下限的考察 將1.4.3項(xiàng)下方法制得的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，以1.4.1項(xiàng)下條件分析后，數(shù)據(jù)采用加權(quán)(1/X2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，以石斛堿與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比(Y)對(duì)應(yīng)石斛堿質(zhì)量濃度(X)求得的直線回歸方程，Y= -0.675 8 + 0.139 3X(r=0.998 8)。結(jié)果表明，在912.94～9.129 4 ng/mL范圍內(nèi)，血漿中石斛堿質(zhì)量濃度與峰面積的比值呈良好線性關(guān)系。血漿中石斛堿的LLOQ為3.043 ng/mL，信噪比率(S/N)大于10。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察 精密吸取15份來源不同的空白血漿各100 μL，加入200 μL乙腈，渦旋30 s，13 000 rpm離心10 min。分別精密吸取150 μL，加入對(duì)照品工作液10 μL，制得低、中、高石斛堿濃度的血漿基質(zhì)樣品。再加入內(nèi)標(biāo)工作液10 μL，渦旋30 s，13 000 rpm離心10 min，取上清50 μL進(jìn)行UPLC-MS分析，石斛堿和內(nèi)標(biāo)峰面積分別記作A1和B1。精密吸取15份100 μL水，加入200 μL乙腈，渦旋30 s，13 000 rpm離心10 min，分別取上清150 μL，加入對(duì)照品工作液10 μL，制得低、中、高石斛堿濃度的無基質(zhì)樣品。再加入內(nèi)標(biāo)工作液10 μL，渦旋30 s，13 000 rpm離心10 min，取上清50 μL進(jìn)行UPLC-MS分析，石斛堿和內(nèi)標(biāo)峰面積分別記作A2和B2。石斛堿基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)按公式ME=A1/A2×100%進(jìn)行計(jì)算，內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)按公式ME=B1/B2×100%進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算結(jié)果顯示，石斛堿的基質(zhì)效應(yīng)在95.5%～110.2%，RSD 小于6.0%，內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)為107.1%，RSD 為5.3%，說明血漿對(duì)石斛堿和內(nèi)標(biāo)化合物不存在基質(zhì)效應(yīng)，不影響血漿樣品準(zhǔn)確定量分析。

2.4 提取回收率的考察 將1.4.3項(xiàng)下方法制得的高、中、低濃度質(zhì)控血漿樣品進(jìn)行UPLC-MS分析，峰面積分別與基質(zhì)效應(yīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中A1、B1比較，計(jì)算石斛堿和內(nèi)標(biāo)的提取回收率。計(jì)算結(jié)果表明，石斛堿的平均提取回收率為93.6%～109.4%，RSD小于8.7%，內(nèi)標(biāo)的平均提取回收率為97.8%，RSD為7.5%。

2.5 精密度和準(zhǔn)確度的考察 將1.4.3項(xiàng)下方法制得高、中、低濃度質(zhì)控血漿樣品進(jìn)行UPLC-MS分析，計(jì)算精密度和準(zhǔn)確度。計(jì)算結(jié)果顯示，石斛堿和內(nèi)標(biāo)化合物的日內(nèi)精密度RSD%均小于9.1%，日間精密度RSD%均小于10.3%，準(zhǔn)確度均在92.5%～104.9%，符合方法學(xué)的要求。

2.6 穩(wěn)定性的考察 將1.4.3項(xiàng)下方法配制高、中、低濃度的質(zhì)控血漿樣品，分別15 ℃放置24 h，-70 ℃保存并反復(fù)凍融3次，以及-70 ℃保存15 d后，以UPLC-MS檢測(cè)，按隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品測(cè)得濃度與標(biāo)識(shí)濃度的偏差 (RE%) ，以此考察樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，石斛堿和內(nèi)標(biāo)化合物在上述保存條件下，測(cè)得值與標(biāo)識(shí)值的相對(duì)偏差均小于11.6%，樣品穩(wěn)定，均能達(dá)到測(cè)定要求。

2.7 金釵石斛細(xì)粉大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的研究 大鼠經(jīng)灌胃給予金釵石斛細(xì)粉后，于不同時(shí)間點(diǎn)采集血漿樣本，處理后的樣品采用建立的UPLC-MS檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，給藥后2 min 石斛堿已經(jīng)吸收入血，在給藥劑量下石斛堿的時(shí)間-濃度曲線(見圖3)。應(yīng)用非房室模型方法(統(tǒng)計(jì)矩法)計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，評(píng)價(jià)金釵石斛主要成分石斛堿在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果(見表1)。

圖3 大鼠灌胃金釵石斛細(xì)粉(0.8 g/kg)后石斛堿平均血藥濃度-時(shí)間曲線(n=7)

表1大鼠灌胃金釵石斛細(xì)粉(0.8 g/kg)后石斛堿的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=7)

檢測(cè)結(jié)果t1/2(min)Tmax(min)Cmax(μg/L)AUC(0-t)(μg·min-1/L)AUC(0-∞)(μg·min-1/L)Vz(L/kg)CLzL/(min·kg)MRT(0-t)(min)MRT(0-∞)(min)平均值351.9511.71212.1716573.2117792.4988.110.18288.31403.05RSD(%)21.9520.6718.9213.1716.5815.6116.3018.6120.45

3 討論

本研究借助已有的文獻(xiàn)報(bào)道[1-13]，鎖定金釵石斛藥材主要有效物質(zhì)成分之一的生物堿，并以其特征代表性成分石斛堿為指標(biāo)，采用UPLC-MS分析系統(tǒng)，建立了針對(duì)大鼠血漿樣品進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法，并應(yīng)用于金釵石斛在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。通過研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠口服給藥金釵石斛細(xì)粉(0.8 g/kg)，以石斛堿為指標(biāo)考察其藥代動(dòng)力學(xué)特征，血漿中石斛堿濃度平均達(dá)峰時(shí)間為11.71 min，最大血藥濃度平均值為212.17 μg/L，平均半衰期為351.95 min。由表觀分布容積(Vz= 88.11 L/kg)可以看出，口服金釵石斛細(xì)粉后石斛堿在體內(nèi)具有較廣的分布。這一結(jié)論與課題組前期考察石斛堿組織分布的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合，在心、肝、脾、肺、腎、腦、腸組織中均能發(fā)現(xiàn)石斛堿，且在肝臟和腸組織中分布較多。通過考察證明，在相同的檢測(cè)分析條件下，鹽酸偽麻黃堿響應(yīng)良好，與目標(biāo)化合物石斛堿保留時(shí)間相近且完全分離，無血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)干擾，基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性均滿足方法學(xué)的要求，可以作為內(nèi)標(biāo)化合物。

隨著藥學(xué)研究的發(fā)展，藥代動(dòng)力學(xué)的研究對(duì)于開展藥物毒理學(xué)研究、新藥安全性評(píng)價(jià)等方面具有重要意義，具備良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的藥物才能有更好的應(yīng)用前景。本文僅研究了金釵石斛細(xì)粉單次灌胃給藥后在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征，將進(jìn)一步研究其不同給藥劑量、不同給藥次數(shù)、不同給藥途徑的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征，為更好的開發(fā)與利用金釵石斛提供實(shí)驗(yàn)參考，并為制定臨床給藥方案提供依據(jù)。

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