扶正祛濁法對糖尿病腎病大鼠TLR4/MyD88通路的影響

何燕妮陳 理高祥福

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病微血管重要并發(fā)癥之一，是糖尿病致殘致死的重要原因。糖尿病腎病發(fā)病機制復(fù)雜，研究[1-5]提示，糖類脂質(zhì)代謝紊亂、腎臟血流動力學(xué)改變、血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子等的作用，以及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、遺傳因素易感性等方面參與DN的發(fā)病。最近研究[6-8]認(rèn)為，炎癥在糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）慢性進展引起微血管并發(fā)癥的過程中起到了重要作用，為研究DN發(fā)病機制提供新思路。高糖環(huán)境下，TLR4等炎癥因子在腎組織中的表達(dá)上調(diào)，提示Toll樣受體4（TLR4）參與了糖尿病腎病的炎癥反應(yīng)[9-10]。目前DN常用治療方法，并未明顯降低其嚴(yán)重發(fā)病率和死亡率，給社會家庭帶來巨大經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[11]。本實驗探討中藥扶正祛濁方對糖尿病腎病大鼠腎功能是否有保護作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選用清潔級健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2008-0016。飼養(yǎng)條件：恒溫，溫度控制在（20±1）℃，濕度為50%～60%，光照每12h明暗交替，通風(fēng)8～15次/小時，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。條件設(shè)施許可證號：SCXK（浙）2008-0115。

1.2 實驗藥品及試劑 扶正祛濁方組成：黃芪30g，當(dāng)歸15g，金櫻子30g，芡實15g，丹參、積雪草各30g，山藥、熟地、澤瀉、茯苓各15g，丹皮10g；制法：各生藥混勻，水煎兩遍，取兩次溶液濃縮，制成高（5.28g/mL）、中（2.64g/mL）、低（1.32g/mL）3 種濃度藥液，分別相當(dāng)于同等體質(zhì)量人的12倍、6倍、3倍。由浙江省中山醫(yī)院制劑室提供，經(jīng)高溫消毒后封瓶，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩｛}酸貝那普利片（商品名：洛汀新，規(guī)格：10mg/片，北京諾華制藥有限公司，批號X2586）研末，按照0.2mg/mL濃度的混懸液給藥。鏈脲佐菌素（美國Sigma公司，批號S0130）。兔抗大鼠TLR4抗體（美國Affinity抗體公司，批號O00206）、兔抗大鼠髓樣分化因子88（MyD88）抗體（美國Cell Signaling（CST）公司，批號 0002）、兔抗大鼠 β-actin抗體（AB-land生物技術(shù)杭州有限公司，批號CT36001）、山羊抗兔熒光二抗（美國Li-cor公司，批號 C40325-02）。

2 實驗方法

2.1 造模方法[12]SD大鼠60只隨機分空白組、DN組、扶正祛濁方低、中、高劑量組和洛汀新組共六組，每組10只。除空白組外均予高糖高脂飲食（飼料組成:12.0%熟豬油，20.0%蔗糖，1.0%膽固醇，0.5%膽酸鹽，6%常規(guī)飼料），適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后造模。造模方法參照文獻[12]并結(jié)合本課題組預(yù)實驗經(jīng)驗，SD大鼠禁食不禁水12h后按照55mg/kg劑量予腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立糖尿病大鼠模型。注射72h、7天、10天后分別測血糖，3次血糖均≥16.7mmol/L者，選定為糖尿病動物模型，血糖不達(dá)標(biāo)者再空腹注射一次STZ（按原劑量），72h后測血糖，達(dá)標(biāo)者選定為糖尿病動物模型，血糖仍不達(dá)標(biāo)者棄用；一周后連續(xù)3次測定24h尿微量白蛋白，尿蛋白均≥30mg/24h（0.5g/d）者選定為糖尿病腎病動物模型。

2.2 藥物干預(yù) 造模成功后，空白組、DN組予0.9%氯化鈉溶液按照每天1mL/100g體質(zhì)量灌胃，扶正祛濁方低、中、高劑量組分別按 1.32、2.64、5.28g/mL濃度按每天1mL/100g體質(zhì)量給藥。洛汀新組按每天每公斤體質(zhì)量2mg的劑量灌胃。各組均灌胃8周。

2.3 血糖、腎功能、24h尿微量白蛋白檢測 造模后72h、7天、10天后斷尾取血測隨機血糖。模型建立后、給藥后第4周及給藥后第8周收集各組大鼠24h尿液，用考馬斯亮藍(lán)法檢測24h尿微量白蛋白水平，羅氏血糖儀測尾靜脈隨機血糖；給藥后第8周大鼠麻醉稱重，心臟取血，離心取血清測腎功能、血糖；取大鼠腎組織放入凍存管中-80℃保存。

2.4 Western-blot技術(shù)檢測腎組織中TLR4、MyD88蛋白的表達(dá)水平 迅速從-70℃冰箱取出腎組織塊，取樣的部分腎組織稱重后，放入置于冰上的勻漿器內(nèi)，按照每100mg組織：1mL裂解液的比例，加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液，充分研磨組織塊20min，4℃，12 000r/min離心20min，取上清液移入新的1.5ml離心管中，加入其1/2體積2x上樣緩沖液，BCA法測定蛋白濃度。以SDS-聚丙烯酰胺凝膠為載體進行蛋白電泳，然后將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白分子轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉緩沖液室溫條件下封閉震蕩1h，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10min。將膜與1:500兔抗大鼠TLR4抗體稀釋液充分震蕩，搖床設(shè)定為60r/min，4℃冰箱放置過夜。再次將膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min。將PVDF膜與1:1000山羊抗兔熒光二抗避光常溫封閉1h，用TBST緩沖液避光洗滌。用Odyssey熒光成像系統(tǒng)掃描成像，并定量分析TLR4蛋白的含量。MyD88蛋白檢測步驟同上。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s） 表示，兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗分析，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，各處理組間兩兩比較采用LSD-t法檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠血糖比較 實驗過程中DN組死亡4只；中藥中劑量組死亡1只。造模后，DN組血糖增高顯著，扶正祛濁方低、中劑量組血糖明顯降低，且與DN組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠造模前后血糖值比較（mmol/L，x±s）

3.2 各組大鼠血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平比較

藥物干預(yù)后，扶正祛濁方各劑量組Scr、BUN水平明顯下降，接近空白組水平。而洛汀新組Scr、BUN水平比DN組也有明顯下降（P＜0.05）。其中扶正祛濁方低、中、高劑量組大鼠BUN水平與洛汀新組比較下降更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

3.3 各組大鼠第4周、第8周末24h尿微量白蛋白水平比較 經(jīng)藥物干預(yù)后，扶正祛濁方各劑量組及洛汀新組大鼠24h尿蛋白的排泄量顯著降低，以扶正祛濁方高劑量組最明顯（P＜0.05）。見表3。

表2 各組大鼠血肌酐、尿素氮測定

表3 各組大鼠24h尿微量白蛋白值比較（mg/d，x±s）

3.4 各組大鼠腎組織中TLR4、MyD88蛋白表達(dá)量比較 經(jīng)藥物干預(yù)后，中藥各劑量組TLR4、MyD88蛋白在腎組織中的表達(dá)水平均有不同程度降低，以扶正祛濁方高劑量組效果最明顯（P＜0.05）。見表4、圖1。

表4 各組大鼠腎組織中TLR4、MyD88蛋白表達(dá)水平比較

圖1 各組大鼠腎組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)比較

4 討論

近年研究[13-15]認(rèn)為，DN是區(qū)別于一般炎癥反應(yīng)的慢性代謝性炎癥反應(yīng)。DN是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，被認(rèn)為是“一種慢性炎癥”。高糖環(huán)境下，TLR4/MyD88通路激活后，主要通過核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）始動因子表達(dá)的上調(diào)，來進一步引發(fā)下游炎癥介質(zhì)大量釋放，引起腎臟組織慢性炎癥反應(yīng)。長期慢性炎癥導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞大量浸潤，進一步加重腎臟炎癥損傷[10，16-17]。有研究證實，TLR4、MyD88在促進糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中起到啟動炎癥反應(yīng)的作用[14-17]，提示我們控制血糖、降低炎癥信號通路活化、下調(diào)炎癥因子的釋放能有效降低蛋白尿，抑制腎臟局部微炎癥反應(yīng)以及抗腎臟纖維化，從而起到延緩腎功能進展的作用，為糖尿病腎病的臨床治療提供多種切入點。

宋代趙佶在《圣濟總錄》中明確提出“消腎”病名，DN屬于中醫(yī)“消腎”。基本病機是消渴病日久，久病入絡(luò)，腎絡(luò)損傷，腎體用俱損，導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，陰陽氣血虧虛，符合中醫(yī)“久病及腎”、“久病入絡(luò)”的病變規(guī)律。

扶正祛濁法方中黃芪、山藥、熟地、金櫻子、芡實等益氣固腎以扶正；當(dāng)歸、丹參、積雪草、丹皮等藥物活血祛瘀，配合茯苓、澤瀉化痰以祛濁。近來研究[18]證實，黃芪可有效降低尿蛋白排泄，抑制炎癥因子生成，抗腎間質(zhì)纖維化等。孫雪芳等[19]通過實驗證實黃芪多糖對LPS誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞有保護作用，其機制可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)。李志杰等[20]證實應(yīng)用黃芪多糖干預(yù)后，可以減輕糖尿病腎病大鼠腎臟病理改變，改善腎功能，降低血糖。有臨床實驗研究[21]明確提出，黃芪多糖對TLR4高表達(dá)和NF-κB活化有明顯抑制作用，可作為TLR4活化抑制劑，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)TLR4的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)的作用。山藥控制血糖水平，糾正糖代謝異常，抑制炎癥因子，減輕DN炎癥改變，改善腎功能[22]。動物實驗[23]表明，山藥多糖具有降低血糖、血脂以及延緩腎功能衰竭的作用，改善腎臟微循環(huán)，減少脂質(zhì)在腎實質(zhì)沉積的作用。金櫻子可抑制腎臟纖維化，改善系膜增生，促進細(xì)胞外基質(zhì)降解[24]。芡實降低尿蛋白，下調(diào)炎癥因子的表達(dá)等[25]。丹參可改善腎臟血液循環(huán)，防止免疫復(fù)合物產(chǎn)生和沉積[26]。以上研究表明，扶正祛濁組方中各藥物有抑制炎癥反應(yīng)，下調(diào)炎癥因子高表達(dá)，保護記憶延緩腎功能進展的作用。本實驗結(jié)果表明，扶正祛濁法組方使大鼠腎組織中TLR4、MyD88蛋白表達(dá)下調(diào)抑制TLR4/MyD88炎癥信號通路的活化，阻斷腎固有細(xì)胞釋放大量炎癥介質(zhì)，從而改善糖尿病腎臟疾病大鼠腎組織的炎癥性損傷，并有效減少尿蛋白的排泄量，延緩DN病情進展，對糖尿病腎臟疾病有著良好的調(diào)節(jié)血糖、保護腎臟的作用，其具體機制有待進一步深入研究。

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