加熱方式和加熱時間對魚類明膠理化性質(zhì)的影響

胡顏寓，陳鳳穎，曹文琪，翁武銀

（集美大學食品與生物工程學院，福建廈門 361021）

明膠是膠原的部分變性產(chǎn)物，可以從動物的皮、骨、肌腱和膜等結締組織中通過稀酸或稀堿處理后利用熱水浸提制備獲得[1]。明膠具有良好的成膜性、發(fā)泡性和乳化性等特征，作為一種高分子生物材料可以廣泛應用于食品、醫(yī)藥等領域[2]。在食品工業(yè)中，明膠可以作為穩(wěn)定劑、乳化劑及增稠劑等[3]。在醫(yī)藥領域，明膠可以應用于組織工程、抗菌包裝及膠囊制作等[4]。明膠凝膠是一種熱可逆凝膠，在升溫和降溫過程中會發(fā)生溶膠-凝膠轉變，因此明膠制品具有獨特的感官性質(zhì)和風味控釋作用[5?6]。

明膠粉末一般擁有半結晶結構，在使用前需要先經(jīng)過冷水浸泡溶脹，再加熱至40 ℃以上使明膠大分子溶解[7]。熱處理的溫度和時間對明膠的凝膠特性和成膜性能有一定的影響。魚鱗明膠在60 ℃下伴隨加熱時間的延長，其制備的凝膠強度會發(fā)生下降[8]。豬皮明膠在加熱溫度從30 ℃提升到70 ℃時分子量會發(fā)生下降，而牛骨明膠在40 ℃下隨加熱時間的延長降解程度增加[9]。Hoque等[10]發(fā)現(xiàn)熱處理溫度超過70 ℃時烏賊皮明膠會發(fā)生降解，進而使明膠的成膜性能下降。這些結果表明了在熱處理過程中不同種類明膠都會發(fā)生降解，從而導致明膠的凝膠特性和成膜性能發(fā)生下降。而且，為了降低能源成本，在實際應用中還有可能采用間歇加熱替代連續(xù)加熱的方式。然而，有關連續(xù)加熱和間歇加熱對魚類明膠性能影響的比較研究卻未見報道。

隨著經(jīng)濟發(fā)展和生活水平的提高，世界各國魚類加工產(chǎn)品逐漸增多，同時產(chǎn)生了大量膠原蛋白含量豐富的魚皮和魚鱗等下腳料[11]。傳統(tǒng)明膠一般是從哺乳動物的皮和骨中制備得到，但這些來源的明膠由于具有疾病傳播可能和一些地區(qū)宗教文化限制而受到影響，促使人們想從魚類下腳料中尋找替代來源[3,12]。因此，本研究考察了加熱方式和加熱時間對魚類明膠的粘度、分子量分布、流變性質(zhì)、熱穩(wěn)定性、明膠凝膠性能和微觀結構的影響，以期為魚類明膠的工業(yè)化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚類明膠（凍力約為280 Bloom） 由集美大學水產(chǎn)品加工研究室提供，是由魚鱗經(jīng)過堿處理去除雜蛋白和酸處理脫鈣后，利用熱水浸提獲得；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺等試劑（化學純） 美國Bio-Rad公司。

BHS-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 中國福州泰美實驗儀器有限公司；DV-C數(shù)顯粘度計 美國Brookfield公司；Mini-PIII垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司；G:Box凝膠成像儀 英國Syngene公司；DHR-2流變儀、Q2000差示掃描量熱儀 美國TA儀器有限公司；TA-XT Plus質(zhì)構儀 英國Stable Micro System 公司；S-4800電子掃描顯微鏡 日本東京日立制造所。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚類明膠溶液的制備 向魚類明膠顆粒（30 g）中加入70 mL蒸餾水于室溫下溶脹30 min，置于60 ℃水浴鍋中連續(xù)加熱1 h（對照組）、12、24、48、96 h制備成連續(xù)加熱的樣品。實際應用中，當天未使用完的明膠通常冷藏后在第2 d重新加熱使用。因此在本實驗中，溶脹的明膠在60 ℃每次加熱12 h，間歇12 h（4 °C），再加熱12 h，直到加熱時間達到24、48和96 h，以加熱1 h的明膠溶液作為對照組，制備成間歇加熱的樣品。根據(jù)明膠質(zhì)地評價方法中使用的標準濃度[13]，用蒸餾水調(diào)配明膠質(zhì)量濃度為6.67%。明膠溶液放在30 ℃水浴鍋中保溫1 h，供以下實驗使用。

1.2.2 魚類明膠SDS-PAGE分析 參考Weng等[14]的方法將樣品溶于8 mol/L尿素、2% SDS和20 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）中，利用6%分離膠和4%濃縮膠在8 mA恒定電流下進行電泳。電泳結束后利用染色液染色2 h，再用脫色液（甲醇:乙酸:水=3:1:6，v/v/v）脫色至背景色透明，最后用凝膠成像儀拍照并保存。

1.2.3 魚類明膠溶液粘度的測定 參考Hu等[15]的方法，利用數(shù)顯旋轉粘度計對明膠溶液的粘度進行測定。選擇s61型轉子，轉速為100 r/min，旋轉30 s后記錄數(shù)據(jù)。粘度單位以厘泊（cp）表示，每個樣品均重復測定3次。

1.2.4 明膠溶液流變性質(zhì)的測定 參考Ma等[16]報道的方法并稍作修改，利用流變儀對明膠溶液的流變性質(zhì)進行測定。取適量樣品置于間隙為1 mm的平行板（直徑為40 mm）之間，于45 ℃下平衡5 min后，在線性粘彈性區(qū)域內(nèi)設定應變?yōu)?%，振蕩頻率為1 Hz，于45~5 ℃（冷卻掃描）和5~45 ℃（加熱掃描）范圍內(nèi)以1 ℃/min的速率進行溫度斜坡掃描。記錄明膠溶液的彈性模量（G'）和粘性模量（G''）隨溫度的變化，G'和G''的交點視為明膠的凝膠點和熔化點。

1.2.5 熱穩(wěn)定性分析 利用差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC）對明膠溶液的熱轉變溫度進行掃描測定。準確稱取10 μL明膠溶液置于Tzero鋁盤并密封，在5 ℃下保溫30 min后，以2 ℃/min的速率升溫至50 ℃，掃描后獲得DSC圖譜。以空鋁盤作為對照，用DSC分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.2.6 魚類明膠凝膠的制備 取質(zhì)量濃度為6.67%的明膠溶液30 mL倒入不銹鋼圈（高3.0 cm，直徑3.5 cm）內(nèi)，將兩端密封好后置于4 ℃冰箱平衡凝固制成凝膠，供以下實驗使用。

1.2.6.1 明膠凝膠強度的測定 利用質(zhì)構儀對凝膠強度進行測定。測定時使用5 kg傳感器，直徑為12.7 mm的P-0.5 s探頭，測試速率為0.5 mm/s。穿透距離為4 mm時所施加的力表示凝膠強度，以“g”為單位。實驗于室溫下進行并重復測定3次。

1.2.6.2 明膠凝膠的質(zhì)構（texture profile analysis，TPA）參數(shù)測定 利用質(zhì)構儀P-50探頭對明膠凝膠連續(xù)兩次擠壓形變30%，間隔時間5 s，測試速度為0.5 mm/s，對凝膠樣品進行TPA分析。實驗于室溫下進行并重復測定3次。

1.2.6.3 明膠凝膠的微觀結構 參考Fang等[17]報道的方法，從凝膠樣品中切下長度為3 mm、厚度為2 mm的薄塊，隨后浸泡在含有2.5%（v/v）戊二醛的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.2）中固定24 h。隨后用0.1 mol/L PBS（pH7.2）漂洗，再用乙醇梯度脫水。經(jīng)CO2臨界干燥后固定在導電膠帶上并利用離子濺射儀鍍金，最后利用電子顯微鏡進行觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)結果用平均值±標準差表示。采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA），并通過Duncan多重比較對數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗分析，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 加熱對魚類明膠分子量的影響

明膠的分子量分布與其物理性能等息息相關，尤其是高分子量組分的變化會對工業(yè)應用產(chǎn)生一些影響[11]。從圖1中可以觀察到，魚類明膠（對照）主要含有分子量約為130、110 kDa的α1和α2肽鏈，以及高于200 kDa的β肽鏈，還有少量高分子量組分和110 kDa以下的低分子量組分。在連續(xù)加熱過程中，隨著加熱時間的延長，明膠分子α1、α2和β條帶逐漸變淺。當加熱到48 h以上時β條帶消失，加熱到96 h以上時α1和α2條帶明顯降解，高分子量組分減少，而低分子量組分增多。這是由于明膠分子在加熱過程中氫鍵及肽鍵受熱斷裂，使得明膠分子發(fā)生降解，從而分子量不斷下降。有學者也證實了豬皮明膠經(jīng)40 ℃加熱72 h明膠分子中的肽鍵被破壞[11]。在間歇加熱的過程中明膠分子也出現(xiàn)了類似的條帶降解的現(xiàn)象，與連續(xù)加熱過程不同的是間歇加熱到96 h以上時β條帶消失，而α1和α2條帶明顯變淺但未消失。這可能是因為間歇加熱明膠在低溫復性過程中，α鏈通過鏈內(nèi)和鏈間的相互作用形成了三螺旋結構[18]。

圖1 加熱方式及加熱時間對魚類明膠SDS-PAGE圖譜的影響Fig.1 Effect of heating method and heating time on SDSPAGE patterns of fish gelatin

2.2 加熱對魚類明膠溶液粘度的影響

粘度可以反映蛋白質(zhì)分子間力的變化，是明膠第二重要的商業(yè)物理性質(zhì)[11]。由圖2可知，對照組中的明膠溶液的粘度為15.82 cp。這與Shakila等[19]報道的從紅鯛魚骨中提取的明膠粘度（15.30 cp）相近，但高于哺乳動物明膠（13.80 cp）。在連續(xù)加熱過程中，明膠的粘度隨著加熱時間的延長呈明顯下降的趨勢。這是由于明膠分子經(jīng)加熱后蛋白質(zhì)聚合物的尺寸會減小，明膠分子中相互作用的氫鍵也會受到較高動能的破壞[20]。隨著加熱時間的延長，這種影響的程度會逐漸增大，使得明膠溶液的粘度不斷減小。在間歇加熱的過程中明膠溶液粘度也出現(xiàn)類似的下降現(xiàn)象，但間歇加熱的明膠樣品粘度下降的幅度比連續(xù)加熱低。這可能與間歇加熱明膠在冷藏期間發(fā)生的復性有關。根據(jù)報道，明膠鏈在復性過程中會通過形成三螺旋而自締合，使明膠的粘度增加[21]。

圖2 加熱方式及加熱時間對魚類明膠溶液粘度的影響Fig.2 Effects of heating method and heating time on the viscosity of fish gelatin solution

2.3 加熱對魚類明膠流變性質(zhì)的影響

魚類明膠樣品在5~45 ℃內(nèi)的升溫和降溫過程中出現(xiàn)的動態(tài)粘彈性曲線如圖3所示。彈性模量（G'）是指凝膠變形時因彈性變形而儲存能量的量，而粘性模量（G''）代表樣品因粘滯變形而造成的能量損耗[22]。在升溫和降溫過程中，G'和G''的交點分別對應明膠的熔化溫度和凝膠溫度[16]。從圖3中可以看出魚類明膠（對照組）熔化點和凝膠點分別為27.75 ℃和18.50 ℃。這與Kasankala 等[23]報道的草魚皮明膠的熔化點（26.8 ℃）和凝膠點（19.5 ℃）溫度相近，但低于Kosaraju等[24]報道的牛皮明膠的熔化點（31.2 ℃）和凝膠點（23.8 ℃）溫度。這主要是與魚類和哺乳動物明膠中亞氨酸含量的差異有關[23]。在連續(xù)加熱的魚類明膠樣品（圖3）中，隨加熱時間的延長，魚類明膠熔化點和凝膠點的溫度均呈下降趨勢。這與明膠因受熱導致較高分子量的組分發(fā)生降解（圖1），形成較多不規(guī)則的短肽鏈甚至氨基酸有關。另外，從圖3也可以看出間歇加熱過程中也有類似的隨加熱時間的延長熔化點和凝膠點溫度下降的現(xiàn)象，但是在相同的加熱時間下間歇加熱的明膠熔化點和凝膠點溫度均高于連續(xù)加熱的樣品。這可能是由于明膠屬于熱可逆膠體，在降溫過程中發(fā)生復性重新形成類膠原三股螺旋結構[25]，從而提高了明膠的熔化點和凝膠點。

圖3 加熱方式及加熱時間對升溫和降溫過程中魚類明膠彈性模量（G'）和粘性模量（G''）的影響Fig.3 Effect of heating method and heating time on the elastic modulus （G'） and the viscous modulus （G''）of fish gelatin during heating and cooling

2.4 加熱對魚類明膠熱轉變溫度的影響

從圖4中可以觀察到魚類明膠在5~50 ℃范圍內(nèi)的DSC掃描均顯示單一的吸熱峰，峰值對應的溫度指的是一半明膠發(fā)生變性所達到的溫度，即螺旋-線圈轉變溫度（Tm）[26]。在連續(xù)加熱過程中，魚類明膠（對照）的轉變溫度為22.71 ℃，這與Norziah等[27]報道的商業(yè)魚膠的轉變溫度（23.74 ℃）接近。隨著連續(xù)加熱時間的延長，魚類明膠的Tm呈明顯下降的趨勢。經(jīng)過96 h連續(xù)加熱，Tm從22.71 ℃降低到17.95 ℃。膠原材料的吸熱過程伴隨著氫鍵的斷裂和三螺旋結構向無規(guī)卷曲結構的重排[26]，因此加熱會使明膠的Tm發(fā)生下降。在間歇加熱的過程中也觀察到類似的變化趨勢，但在相同時間下間歇加熱明膠的Tm比連續(xù)加熱明膠的Tm下降幅度小。這是因為間歇加熱明膠在降溫過程中發(fā)生了復性，恢復部分螺旋結構[28]。Yoshimura等[29]在比較鯊魚皮明膠與豬皮明膠時報道了明膠的結構穩(wěn)定性與Tm呈正相關。因此，圖4的結果也表明了在相同加熱時間下間歇加熱的明膠結構比連續(xù)加熱的明膠穩(wěn)定。

圖4 加熱方式及加熱時間對魚類明膠熱分析圖譜的影響Fig.4 Effects of heating method and heating time on thermograms of fish gelatin

2.5 加熱對魚類明膠凝膠強度的影響

魚類明膠具有形成熱可逆凝膠的獨特性質(zhì)，在低溫狀態(tài)下明膠分子會相互纏繞通過交聯(lián)形成具有三維網(wǎng)絡結構的凝膠[30]。因此，凝膠強度也作為明膠凝膠性能的重要衡量指標之一[10]。由圖5可知，魚類明膠（對照）的凝膠強度為266.53 g，類似于Kasankala等[23]報道的草魚皮明膠凝膠（267 g）。也有文獻報道，利用黃鰭金槍魚皮制備的明膠其凝膠強度可以高達426 g[30]，而利用尼羅河鱸魚幼魚皮制備的明膠其凝膠強度只有217 g[31]。這些凝膠強度的差異可能與魚的種類，以及明膠的提取方法有關[27]。從圖5中還可以觀察到，在連續(xù)加熱過程中魚類明膠的凝膠強度隨加熱時間的延長逐漸減小。明膠的凝膠強度主要取決于α、β肽鏈和游離羥基氨基酸的含量[19,32]。因此，明膠凝膠強度的減小可能是由于明膠分子中的α和β肽鏈在加熱過程中逐漸降解（圖1）。在間歇加熱過程中，魚類明膠的凝膠強度也出現(xiàn)隨加熱時間的延長逐漸減小的趨勢，但減小的程度低于連續(xù)加熱（圖5）。明膠由于具有溶膠-凝膠熱可逆轉變特性，在低溫條件下能夠發(fā)生三螺旋結構的復性[33]。有研究表明，明膠羥脯氨酸羥基可以與游離水分子之間形成氫鍵和穩(wěn)定三股螺旋結構[27]。因此，間歇加熱的明膠分子在降溫過程中發(fā)生復性形成氫鍵，一定程度上抑制熱降解，保持較好的凝膠形成能力。明膠質(zhì)量根據(jù)凍力凝凍強度可分為低凝膠強度（<150 g）、中凝膠強度（150~200 g）和高凝膠強度（220~300 g）三個水平[26]。為了保證明膠的質(zhì)量，建議加熱時間應小于12 h以保持明膠的高凝膠強度。

圖5 加熱方式及加熱時間對魚類明膠凝膠強度的影響Fig.5 Effects of heating method and heating time on the gel strength of gelatin gel

2.6 加熱對魚類明膠凝膠TPA的影響

魚類明膠凝膠的TPA測定結果能夠客觀反映其力學性質(zhì)[34]。由表1可以看出，魚類明膠經(jīng)加熱12 h制備的明膠凝膠的硬度、膠著性和彈性均無明顯變化。當加熱時間超過12 h，隨著加熱時間的延長，硬度等TPA參數(shù)均呈下降趨勢。硬度反映的是明膠的凝膠特性，而膠著性是硬度的補充參數(shù)[34]。伴隨加熱時間的延長，明膠α、β肽鏈逐漸發(fā)生熱降解（圖1），結果導致明膠凝膠的硬度等TPA參數(shù)發(fā)生下降。另一方面，由表1可以觀察到，在相同加熱時間下，間歇加熱的明膠其凝膠的硬度、膠著性和彈性均比連續(xù)加熱明膠樣品高。這種變化趨勢類似于明膠α、β肽鏈熱降解的變化趨勢（圖1），再次表明了間歇加熱可以抑制明膠的熱降解，有利于形成高硬度的凝膠。

表1 加熱方式及加熱時間對魚類明膠凝膠TPA參數(shù)的影響Table 1 Effect of heating method and heating time on TPA parameters of gelatin gel

2.7 加熱方式及加熱時間對魚類明膠凝膠微觀結構的影響

圖6 展示了明膠凝膠樣品的微觀結構。從對照樣品中觀察到明膠凝膠含有松散的網(wǎng)絡結構并且網(wǎng)絡中孔隙較大。Huang等[35]也從鳙魚魚鱗明膠制備的凝膠中觀察到類似的結果。這是由于在凝膠化過程中無規(guī)卷曲明膠鏈發(fā)生復性纏繞成螺旋結構，進而形成三維網(wǎng)絡狀，并將水分子通過相互作用包裹于其中[7]，脫水和干燥處理使水分子消失留下大量孔隙。然而加熱時間為12 h時，明膠凝膠中孔隙明顯減少，表面呈皺縮塊狀。在連續(xù)加熱過程中，加熱時間12~96 h，明膠凝膠樣品表面越來越光滑平整。這可能是隨著加熱時間的延長，明膠不斷受熱降解，分子量逐漸下降（圖1），小分子量肽段更容易填充于凝膠網(wǎng)絡的孔隙中的緣故。經(jīng)間歇加熱明膠制備的凝膠樣品中也能發(fā)現(xiàn)類似的趨勢，但在相同時間下經(jīng)間歇加熱處理的樣品其形態(tài)比連續(xù)加熱的樣品更粗糙且具有更多的孔隙。這可能與間歇加熱明膠的分子量以及制備的凝膠強度高于連續(xù)加熱的樣品（圖1和圖5）有關。這些結果證實了間歇加熱在一定程度上抑制了明膠的熱降解。

圖6 加熱方式及加熱時間對魚類明膠凝膠微觀結構的影響Fig.6 Effect of heating method and heating time on the microstructure of gelatin gel

3 結論

本研究主要考察了加熱方式和加熱時間對魚類明膠性質(zhì)的影響。魚類明膠的粘度、流變性質(zhì)及熱穩(wěn)定性均隨加熱時間的延長明顯下降。魚類明膠制備的凝膠其凝膠強度和TPA參數(shù)也隨熱處理時間的延長不斷減小，而由間歇加熱制備的凝膠其凝膠性能和TPA參數(shù)均優(yōu)于連續(xù)加熱樣品。這主要是由于間歇式加熱的冷卻過程有助于明膠蛋白復性，一定程度上抑制了明膠蛋白的熱降解，因而形成的凝膠表面形態(tài)比連續(xù)加熱樣品具有更多的孔隙。本研究的結果表明，為了保證魚類明膠的質(zhì)量以及降低能源成本，建議連續(xù)加熱時間不超過12 h，本文結果可以為魚類明膠在工業(yè)上的應用提供參考。