超聲聯(lián)合SDF-1微泡對(duì)糖尿病性心肌病大鼠心肌損傷的保護(hù)作用

王琳琳，李文建，李易明，楊 漪，閆鳳琴

(1. 哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院，河北 衡水 053100；2. 河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050017)

隨著人們飲食習(xí)慣的改變，糖尿病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病之一，并呈現(xiàn)高發(fā)病率、高致殘率及高病死率的趨勢(shì)。糖尿病性心肌病(DCM)是糖尿病損傷心血管系統(tǒng)所致的重要并發(fā)癥之一，其是導(dǎo)致糖尿病患者高病死率的主要原因之一[1-2]。臨床上常采用藥物控制DCM早期發(fā)展，但對(duì)于DCM發(fā)展過(guò)程中心肌纖維化導(dǎo)致心室重塑、心功能不全的治療效果并不理想。近年研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs )或內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)植入受損心肌組織中，通過(guò)細(xì)胞增殖分化再生，可降低心肌纖維化程度，改善心臟泵血功能[3-4]。但由于血液循環(huán)和淋巴引流的原因，大量的干細(xì)胞并沒(méi)有歸巢到心臟組織，從而影響干細(xì)胞移植的治療效果。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)主要分布在骨骼、大腦、心臟等臟器，其配體CXC族趨化因子受體4(CXCR4)則在MSCs和EPCs表面高度表達(dá)。本研究旨在探討超聲聯(lián)合SDF-1微泡對(duì)糖尿病性心肌病大鼠心肌損傷的保護(hù)作用，為DCM的治療提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量300 g左右，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：1704024。

1.2試劑及儀器 微泡造影劑(意大利Bracco公司)；肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；CXCR4兔抗鼠單抗(美國(guó)Abcam 公司)；Trizol RNA抽提試劑、Real-time ScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaTM熒光定量PCR試劑盒(日本Takara 公司)；Nanodrop ND-2000(美國(guó)Gene 公司)；7500型熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；超聲治療儀(重慶醫(yī)科大學(xué)超聲中心)；蛋白印跡試驗(yàn)裝置(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將40只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只。除空白組外，其余組均參考文獻(xiàn)[5]方法制備DCM模型，即大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)4周，第5周開(kāi)始給予1%鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg 腹腔注射1周，第20周后尾靜取血測(cè)得血糖濃度>16.7 mmol/L為DCM造模成功。造模成功后，SDF-1組經(jīng)尾靜脈輸入SDF-1溶液10 ng/kg；SDF-1+超聲組經(jīng)尾靜脈輸入SDF-1溶液10 ng/kg，然后采用2%戊巴比妥鈉1 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，利用超聲治療儀(頻率為1 MHz，強(qiáng)度為1 W/cm2)輻照大鼠心前區(qū)10 min；微泡+超聲組經(jīng)尾靜脈輸入含有10 ng/kg SDF-1 的微泡混合液(按照說(shuō)明書(shū)將5 mL生理鹽水注入Sono Vue干粉瓶中，使用前用力晃動(dòng)產(chǎn)生微泡即可)，然后采用2%戊巴比妥鈉1 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，利用超聲治療儀(頻率為1 MHz，強(qiáng)度為1 W/cm2)輻照大鼠心前區(qū)10 min。

1.4檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1心肌生化指標(biāo) 干預(yù)4 d后，每組隨機(jī)選取大鼠3只，麻醉后留取血清，分別檢測(cè)血清中CK、LDH和cTnI含量。

1.4.2心功能指標(biāo) 干預(yù)8周后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉1 mL/kg麻醉各組大鼠。采用M型超聲儀，位于左心室乳頭肌短軸切面處測(cè)定左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左心室舒張末壓(LVEDP)和左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.4.3心肌組織中CXCR4蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè)。干預(yù)8周后，處死各組大鼠，取心肌組織冷凍研磨后，加入蛋白裂解液提取蛋白并進(jìn)行蛋白定量。隨后將蛋白樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳分離，再以300 mA恒流電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再加入抗CXCR4單抗4 ℃孵育過(guò)夜，次日TBS-T洗滌3次，5 min/次，加入辣根酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再TBS-T洗滌3次，5 min/次，ECL化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光檢測(cè)信號(hào)。

1.4.4心肌組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)mRNA表達(dá)情況 干預(yù)8周后，處死各組大鼠，取心肌組織冷凍研磨后，加入1 mL TRIzol試劑，反復(fù)吹吸后移入EP管中，按照TRIzol試劑盒使用說(shuō)明提取組織總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程按照TaKaRa試劑說(shuō)明進(jìn)行操作。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，過(guò)程按照TaKaRa試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。引物序列：TGF-β1Forward primer：5’-TTGGAGCCTGGACACACA-3’，Reverse primer：5’-GTAGTAGACGATGGGCAGTGG-3’；β-actin Forward primer：5’-CACCCAGACCAATGAAGAT -3’，Reverse primer：5’- CAAATAAAGCCATGCCAAT-3’。上述引物均由大連寶生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)條件參照TaKaRa試劑說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)相對(duì)定量△△Ct法進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清生化指標(biāo)比較 干預(yù)4 d后，各組大鼠血清CK、LDH和cTnI水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清CK、LDH和cTnI水平比較

2.2各組大鼠心功能指標(biāo)比較 模型組LVIDd、LVEDP均明顯高于空白組(P均<0.05)，LVEF明顯低于空白組(P<0.05)；各干預(yù)組LVIDd、LVEDP均明顯低于模型組(P均<0.05)，LVEF均明顯高于模型組(P均<0.05)，其中微泡+超聲組各項(xiàng)指標(biāo)改善情況均明顯優(yōu)于SDF-1組和SDF-1+超聲組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)比較

注：①與空白組比較，P<0.05；②模型組比較，P<0.05；③與微泡+超聲組比較，P<0.05；1 mmHg=0.133 kPa。

2.3各組大鼠心肌組織中CXCR4蛋白和TGF-β1mRNA表達(dá)情況 干預(yù)8周后，模型組及各干預(yù)組CXCR4蛋白表達(dá)水平和TGF-β1mRNA表達(dá)水平均明顯高于空白組(P均<0.05)，各干預(yù)組TGF-β1mRNA表達(dá)水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；微泡+超聲組CXCR4蛋白表達(dá)水平明顯高于其他組(P均<0.05)，TGF-β1mRNA表達(dá)水平均明顯低于SDF-1組和SDF-1+超聲組(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠心肌組織中CXCR4蛋白和TGF-β1 mRNA表達(dá)情況

注：①與空白組比較，P<0.05；②模型組比較，P<0.05；③與微泡+超聲組比較，P<0.05。

3 討 論

DCM發(fā)病過(guò)程中非心肌細(xì)胞重塑，導(dǎo)致患者心功能不全及泵血能力下降，引發(fā)心力衰竭、休克等并發(fā)癥[6]。目前研究認(rèn)為，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到受損心肌組織周?chē)梢种菩募±w維組織增生，改善心臟功能[7-8]，但心臟功能改善程度與移植干細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)[9]。所以，如何阻止移植后的干細(xì)胞隨血液循環(huán)和淋巴引流分布到肺臟、肝臟等臟器，而是歸巢到心肌組織周?chē)荄CM治療能否成功的關(guān)鍵因素之一。

微泡造影劑作為一種新型轉(zhuǎn)運(yùn)載體，可攜帶藥物、細(xì)胞因子、基因等物質(zhì)，在一定能量超聲輻照下爆破微泡，可在靶組織進(jìn)行精確釋放轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)，從而達(dá)到靶向治療的目的[10]。本研究參考文獻(xiàn)[11]，采用低頻超聲(頻率為1 MHz，強(qiáng)度為1 W/cm2)進(jìn)行體內(nèi)干預(yù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示干預(yù)4 d后各組CK、LDH及cTnI水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明用1 W/cm2的超聲強(qiáng)輻照對(duì)于大鼠心肌組織是無(wú)損傷、安全的。

SDF-1/CXCR4生物軸可以促進(jìn)MSCs歸巢到受損的心肌組織[12]。Zamani等[13]和Won等[14]研究證實(shí)，組織局部釋放SDF-1可與MSCs表面的唯一配體CXCR4相互結(jié)合，募集MSCs靶向運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)其增殖分化修復(fù)受損心肌組織。而TGF-β1主要由心肌成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞產(chǎn)生，其異常增高可能導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維化，其參與受損心肌組織重塑過(guò)程[15]，TGF-β1mRNA 表達(dá)可高低反映組織纖維化程度。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干預(yù)8周后，各干預(yù)組LVIDd、LVEDP均明顯低于模型組，LVEF均明顯高于模型組，且微泡+超聲組各指標(biāo)改善情況均明顯優(yōu)于SDF-1組和SDF-1+超聲組，提示超聲結(jié)合SDF-1微泡能更有效改善心臟泵血功能。模型組及各干預(yù)組CXCR4蛋白表達(dá)水平和TGF-β1mRNA表達(dá)水平均明顯高于空白組，各干預(yù)組TGF-β1mRNA表達(dá)水平均明顯低于模型組；微泡+超聲組CXCR4蛋白表達(dá)水平明顯高于其他組，TGF-β1mRNA表達(dá)水平均明顯低于SDF-1組和SDF-1+超聲組。表明靜脈注射SDF-1對(duì)DCM大鼠心肌損傷有一定保護(hù)作用，但單純超聲輻照并沒(méi)有增加SDF-1的治療效果，而含有SDF-1的微泡在超聲輻照下爆裂，可增加心肌組織周?chē)鶶DF-1藥物濃度，可更有效保護(hù)心肌組織。

綜上所述，微泡造影劑在一定能量超聲輻照下可精確釋放SDF-1，最大限度靶向增加心肌組織周?chē)鶶DF-1藥物濃度，通過(guò)SDF-1/CXCR4生物軸作用，將高表達(dá)CXCR4的MSCs募集到心肌組織周?chē)?，其增殖分化再生，阻止心肌纖維化再塑，增強(qiáng)心臟泵血功能，這對(duì)于應(yīng)用微泡造影劑來(lái)介導(dǎo)MSCs的歸巢研究提供了強(qiáng)有力的支持，為DCM的治療提供了一種新思路，有一定的應(yīng)用前景。

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