水稻“抗癌”新因子bsr-d1

李偉滔，朱紫薇，尹俊杰，賀閩，王靜，朱孝波，陳學(xué)偉

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，成都 611130

水稻是重要的糧食作物，世界約一半的人口以它為主食。然而，水稻第一大真菌病害——稻瘟病，被稱為水稻“癌癥”，嚴(yán)重危害水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。自20世紀(jì)60年代中期起，科學(xué)家便開始了鑒定和克隆水稻稻瘟病抗性相關(guān)基因的工作。目前鑒定到的稻瘟病抗性(resistance，R)基因中，已有28個被成功克隆。這些基因中，僅Pid2和Pi21屬于非經(jīng)典R基因[2-3]。R基因聚合是當(dāng)前水稻抗病育種的主要技術(shù)手段，但費時費力，而在水稻抗病育種中能夠直接被應(yīng)用的廣譜抗病基因資源匱乏，嚴(yán)重限制了抗病育種技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用。本文介紹了如何挖掘水稻廣譜抗稻瘟病遺傳位點bsr-d1并解析其抗病機理，同時闡述了其潛在的育種應(yīng)用價值。

1 挖掘廣譜抗稻瘟病遺傳位點bsr-d1

水稻“地谷”是福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院在20世紀(jì)90年代初育成的水稻保持系，具有對稻瘟病的廣譜持久高抗性[4]。盡管已從“地谷”中鑒定并克隆出兩個抗病基因——Pid2和Pid3，但這兩個基因均具有小種特異性抗性[2,5]。近期研究表明“地谷”的廣譜持久抗性既不同于LysM結(jié)構(gòu)域蛋白，如幾丁質(zhì)誘導(dǎo)物結(jié)合蛋白(CEBiP)等所介導(dǎo)的抗性，也不同于含有核苷酸結(jié)合位點和富含亮氨酸重復(fù)序列(NBS-LRR)的蛋白介導(dǎo)的抗性[4]。因此，“地谷”中可能存在其他新型因子來介導(dǎo)對稻瘟病的廣譜持久抗性。

農(nóng)作物如果攜帶了廣譜抗病基因，則不會因為病原菌的變異而失去抗性，因此在田間表現(xiàn)出持久抗病性。然而，抗病基因常伴隨著品質(zhì)差或產(chǎn)量低的副作用，因此在育種中難以利用。采用常規(guī)的遺傳定位的方法，獲得的抗病相關(guān)基因通常具有小種特異性。如：前期從“地谷”中鑒定并克隆的Pid2和Pid3，均具有小種特異性抗性[2,5]。因此，很難用這種方法尋找到廣譜抗病位點。我們研究團隊針對水稻“地谷”的重測序數(shù)據(jù)，以及從國家作物基因資源庫中隨機篩選得到的66份非廣譜抗病水稻材料的重測序數(shù)據(jù)，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)獲得“地谷”的特異的單核苷酸多態(tài)性位點(singlenucleotide polymorphism，SNP)。然后，利用稻瘟病抗病材料“地谷”和易感稻瘟病材料“麗江新團黑谷”構(gòu)建重組自交系群體(recombinant inbred line，RIL)。首先篩選“地谷”特異的SNP，并將分布在外顯子內(nèi)改變氨基酸變化或?qū)е路g提前終止的SNP，以及位于啟動子1.5 kb內(nèi)且位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件的核心序列內(nèi)的SNP作為候選分析有效的SNP。然后，利用構(gòu)建的RIL群體，從中篩選到不含Pid2和Pid3，且表型與麗江新團黑谷相似的株系作為候選基因的篩選材料。將稻瘟病病區(qū)種植所選的RIL株系種植于大田自然發(fā)病區(qū)，進行抗性鑒定。然后，利用篩選到的SNP，開發(fā)衍生的酶切擴增多態(tài)性序列(dCAPS)標(biāo)記。利用分子標(biāo)記與RIL株系抗性結(jié)果的關(guān)聯(lián)分析，明確了與稻瘟病廣譜抗性相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵位點SNP33，它位于MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件的核心序列內(nèi)。我們將這個SNP33所在的基因命名為Bsr-d1，而“地谷”中對應(yīng)的基因即為bsr-d1[6]。

2 Bsr-d1編碼一個新的稻瘟病抗病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子

為分析Bsr-d1的分子功能，我們分別構(gòu)建了Bsr-d1的RNA干涉、CRISPR/Cas9基因敲除和過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻株系。通過稻瘟病接菌試驗，發(fā)現(xiàn)Bsr-d1的RNA干涉和CRISPR/Cas9敲除株系均表現(xiàn)出稻瘟病抗性增強，并且這種抗性具有廣譜性，而過量表達(dá)株系表現(xiàn)為抗性減弱[6]。因此，bsr-d1是調(diào)控稻瘟病廣譜抗性的新的遺傳位點。

Bsr-d1編碼一個C2H2家族的轉(zhuǎn)錄因子，它對稻瘟病抗性起著負(fù)調(diào)控作用。在植物免疫信號傳導(dǎo)中，轉(zhuǎn)錄因子精細(xì)調(diào)控下游靶基因是調(diào)控防御機制所必須的[7]。利用基因芯片(microarray)和轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)技術(shù)，已鑒定出大量受病原菌影響的轉(zhuǎn)錄因子[4,8]，這些參與植物抗病的轉(zhuǎn)錄因子主要分布在5個轉(zhuǎn)錄因子家族中——WRKY、APETALA2/乙烯應(yīng)答因子(AP2/ERF)、堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)、堿性螺旋-環(huán)-螺旋類轉(zhuǎn)錄因子(bHLH)和NAM/ATAF/CUC(NAC)[7]。此前，尚未報道C2H2類型轉(zhuǎn)錄因子對植物抗病的調(diào)控作用。

Bsr-d1屬于調(diào)控稻瘟病抗性的一類新的非WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子。目前，水稻中參與稻瘟病抗性的轉(zhuǎn)錄因子多屬于WRKY家族[9]，而調(diào)控稻瘟病抗性的非WRKY轉(zhuǎn)錄因子還十分少見，僅有OsERF922和OsNAC111。OsERF922負(fù)調(diào)控水稻稻瘟病的抗性，其主要影響苯丙氨酸氨裂解酶基因和雙萜類植物抗毒素合成相關(guān)基因的表達(dá)[10]；OsNAC111正調(diào)控水稻的稻瘟病抗性，這依賴于它對幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶基因表達(dá)的激活作用[11]。Bsr-d1對稻瘟病抗性并不依賴于OsERF922和OsNAC111[6]。

與大多數(shù)水稻抗病基因編碼受體蛋白不同，bsr-d1基因編碼的是控制免疫反應(yīng)強弱的調(diào)節(jié)蛋白。這可能是稻瘟病菌不能在攜帶該位點的“地谷”上產(chǎn)生強致病性的原因。

3 bsr-d1介導(dǎo)一種新型抗稻瘟病分子機制

活性氧(reactive oxygen species，ROS)爆發(fā)是植物細(xì)胞應(yīng)對病原菌侵害的早期反應(yīng)，它也是病原分子模式激發(fā)的免疫反應(yīng)(PAMPs triggered immunity，PTI)中的一個重要現(xiàn)象[12]。植物細(xì)胞中，過氧化氫(H2O2)作為ROS的主要成分之一，它可通過增強植物細(xì)胞壁來阻擋病原菌的入侵[13]。H2O2還可介導(dǎo)植物防御反應(yīng)的信號級聯(lián)放大，從而產(chǎn)生抗病反應(yīng)[14]。例如：H2O2能夠激活抗病相關(guān)的MPK3/MPK6級聯(lián)反應(yīng)[15]，其中MPK3/MPK6能夠磷酸化WRKY33和ERF6，從而調(diào)控抗病相關(guān)的乙烯、抗毒素和吲哚基硫苷的合成，進而影響植物抗病性[15]。

ROS的爆發(fā)是抗病反應(yīng)的起始，增強ROS合成[13-14]或削弱ROS降解[16]，均可顯著增強植物抗病性。當(dāng)前研究多數(shù)集中于ROS的合成途徑，而有關(guān)ROS降解途徑的研究較少。番茄基因Cat1和Cat2參與降解H2O2，它們的表達(dá)受抑制后，番茄中H2O2積累量增加，PR1蛋白和水楊酸(salicylic acid，SA)含量升高，從而促進細(xì)胞壞死，增強對煙草花葉病毒的抗性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，bsrd1主要調(diào)控過氧化氫酶基因的表達(dá)，以此實現(xiàn)對ROS的調(diào)控(圖1)：在bsr-d1或Bsr-d1敲除水稻中，過氧化氫降解酶基因表達(dá)降低，水稻中過氧化氫降解減弱，導(dǎo)致H2O2富集，使水稻抗病性明顯提高[6]。bsr-d1的這種抗病調(diào)控機制，不同于以往報道的由H2O2合成相關(guān)基因OsRbohA、OsRbohB和OsRbohE介導(dǎo)的抗病機制[17]。

圖1 bsr-d1介導(dǎo)水稻稻瘟病抗性的分子模型。稻瘟病菌侵染水稻后，能夠誘導(dǎo)bsr-d1的上調(diào)表達(dá)，進而使過氧化氫酶上調(diào)表達(dá)，加速了H2O2的降解，從而減少了H2O2的積累，使水稻感病；而“地谷”中，等位基因bsr-d1由于其啟動子位點由原來的A變成G，導(dǎo)致MYBS1強烈地結(jié)合bsr-d1啟動子，抑制bsr-d1的上調(diào)表達(dá)，因此，過氧化氫酶并沒有被誘導(dǎo)表達(dá)，使H2O2保持一定的積累量，以此增強了水稻的稻瘟病抗性

4 bsr-d1的育種應(yīng)用潛力

堊白是衡量稻米品質(zhì)的重要性狀之一，直接影響稻米的外觀品質(zhì)、加工品質(zhì)和商品流通[18]。非R基因中，pi21具有稻瘟病廣譜抗性，但是它與控制堊白的基因LOC_Os04g32890緊密連鎖[3]。水稻育種中，需打破pi21與LOC_Os04g32890的連鎖，才能保證提高抗病性的同時不破壞水稻品質(zhì)，這大大增加了育種難度，因此極大限制了pi21在生產(chǎn)上的實際應(yīng)用。

水稻籽粒堊白相關(guān)的QTL主要位于水稻染色體1、2、4～12[19-20]，而3號染色體上未發(fā)現(xiàn)有控制堊白的QTL。Bsr-d1位于3號染色體前臂靠近著絲粒的位置(Chr3:18 436～18 437 kb)，該位點附近沒有發(fā)現(xiàn)控制堊白及其相關(guān)的基因，故bsr-d1不同于pi21，無需分離與其緊密連鎖的控制堊白的基因即可用于水稻抗性育種。敲除Bsr-d1后，水稻的稻瘟病抗性提高，而與水稻產(chǎn)量相關(guān)的農(nóng)藝性狀以及主要的品質(zhì)性狀——堊白率和堊白度，卻未受到顯著影響。這進一步表明含有與“地谷”位點一致的bsr-d1在育種中具有很大的應(yīng)用潛力。

此外，生物信息學(xué)分析表明，目前已經(jīng)測序的全球3 000份水稻資源中，僅約10%的水稻材料含有與“地谷”bsr-d1相同的等位位點(圖1)[6]，表明bsr-d1具有廣闊的育種應(yīng)用前景。

5 總結(jié)與展望

控制植物病害的主要手段包括施用化學(xué)農(nóng)藥和種植抗病品種。大量施用化學(xué)農(nóng)藥雖能控制病害發(fā)生，但農(nóng)藥的使用不僅增加農(nóng)民種植成本，還不可避免地會導(dǎo)致農(nóng)藥殘留及破壞生態(tài)環(huán)境。作為防控植物病害最經(jīng)濟有效的手段，種植抗病品種可有效保證農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中的資源節(jié)約和環(huán)境保護，這對于生態(tài)文明建設(shè)具有十分重要的意義[21]?？共』?，特別是廣譜抗病基因的挖掘是培育抗病品種的重要基礎(chǔ)。但目前對植物的廣譜抗病基因還知之甚少，已報道的廣譜抗病基因主要包括小麥的Yr36[22]和Lr34[23]，大麥的mlo[24]，擬南芥的RPW8[25]，水稻的STV11[26]、pi21[3]、Xa21[27]、Xa23[28]、Pi9[29]和Pigm[30]。

本文通過全基因組關(guān)聯(lián)分析和遺傳群體的結(jié)合利用，篩選和鑒定出“地谷”中的廣譜抗病位點bsr-d1，為克隆控制目標(biāo)性狀的基因提供了新策略。Bsr-d1編碼的蛋白能調(diào)節(jié)水稻對稻瘟病的免疫反應(yīng)程度，以防止水稻因過度免疫造成自身傷害。稻瘟病菌中可能存在一個或一些未知的因子，通過誘導(dǎo)Bsr-d1高量表達(dá)，使過氧化氫酶過量表達(dá)，加速H2O2的降解，從而減少H2O2的積累，降低水稻對稻瘟病菌的抵抗能力?！暗毓取敝械腷sr-d1基因通過自然變異，不再“聽令”于稻瘟病菌，在受到稻瘟菌侵染時不會增加表達(dá)，使得稻瘟病菌的這一個秘密武器失去作用，從而擺脫稻瘟病菌的“控制”[31]。同時，“地谷”的bsr-d1具有對稻瘟病的廣譜抗性，且對水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)性狀無顯著影響，為水稻的抗病育種工作提供了更有效的目標(biāo)基因，在水稻抗病育種中具有很大的應(yīng)用潛力。

(2017年9月6日收稿)■

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