霍山石斛多糖對(duì)衰老模型大鼠腸道消化吸收功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

徐海軍，高溫婷，楊 健，張亞妮，谷仿麗，何曉梅，喬德亮

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院健康養(yǎng)殖與動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)預(yù)警工程技術(shù)中心，安徽 六安 237012；2.安徽省植物細(xì)胞工程技術(shù)中心，安徽 六安 237012)

我國(guó)已進(jìn)入老齡化社會(huì)。提高老年人的身體健康水平，減少相關(guān)老年疾病的發(fā)生，對(duì)于降低社會(huì)的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，提高老年人的生活質(zhì)量均非常重要。腸道是動(dòng)物消化吸收食物中營(yíng)養(yǎng)素的主要場(chǎng)所，也是動(dòng)物機(jī)體接觸環(huán)境病原微生物及有毒物質(zhì)的主要部位。中醫(yī)學(xué)自古就有“腸道乃百病之源”的說(shuō)法?？梢?jiàn)保持腸道健康非常重要?；羯绞橇彩谢羯娇h著名的道地藥材，為歷史悠久的名貴中草藥，是古代“九大仙草”之一。《本草綱目》記載：霍山石斛具有強(qiáng)陰益精，厚腸胃，平胃氣，長(zhǎng)肌肉，益智除驚，輕身延年之功效。研究發(fā)現(xiàn)霍山石斛的主要有效成分為石斛多糖[1-2]。石斛多糖具有降血脂[3-4]、抗氧化[5-7]、增強(qiáng)免疫力[8]等作用。目前關(guān)于霍山石斛或其他石斛多糖的抗衰老作用已有少量研究[9-13]，但對(duì)衰老動(dòng)物腸道健康影響的研究幾乎未見(jiàn)報(bào)道。本項(xiàng)目研究了霍山石斛多糖對(duì)衰老模型大鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、腸道消化酶活力和糞中營(yíng)養(yǎng)素含量的影響，為將霍山石斛開(kāi)發(fā)成抗衰老保健品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk(皖)2011-002。

1.2 藥品與試劑

霍山石斛楓斗由安徽省霍山石斛產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心提供(經(jīng)皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院陳乃富教授鑒定為正品)，參照陳乃東[14]的方法提取霍山石斛精制多糖，用蒽酮-硫酸比色法測(cè)得霍山石斛楓斗多糖含量為29.4%；蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白酶活性測(cè)定試劑盒、淀粉酶活性測(cè)定試劑盒和脂肪酶活性測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；D-半乳糖為Sigma公司產(chǎn)品；氯仿、丙酮、無(wú)水乙醇、正丁醇等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 主要儀器

TU-1901 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；HK-02 A型手提式粉碎機(jī)(廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)；FA1204 B型電子分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；RE-52 AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))；DD5臺(tái)式大容量低速離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

SD大鼠養(yǎng)至4月齡時(shí)開(kāi)始正式試驗(yàn)。將30只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、衰老模型組和衰老模型+霍山石斛多糖組，每組10只。衰老模型大鼠的制作參照文獻(xiàn)[15]方法，每天在頸部皮下注射D-半乳糖125 mg·kg-1·BW-1。對(duì)照組大鼠每天頸部皮下注射等量生理鹽水。衰老模型+石斛多糖組大鼠每天灌胃霍山石斛多糖溶液，劑量為200 mg·kg-1·BW-1。對(duì)照組和衰老模型組大鼠每天灌胃等劑量生理鹽水。每隔7天對(duì)大鼠進(jìn)行一次稱(chēng)重，根據(jù)其體重變化調(diào)整D-半乳糖的注射量和霍山石斛多糖的灌胃量。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

8周后將大鼠頸動(dòng)脈放血處死，剪開(kāi)腹腔，以盲腸為基準(zhǔn)，采集距盲腸基部4cm前的一段回腸食糜，用蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性測(cè)定試劑盒分別測(cè)定三種酶的活性；采取距盲腸基部6cm前的一段回腸，用中性福爾馬林溶液固定，然后制作石蠟切片，測(cè)定小腸絨毛高度和隱窩深度(每只大鼠的回腸作3張不連續(xù)的切片，每張切片上測(cè)定3根伸直且形態(tài)完整的小腸絨毛高度和隱窩深度)；取直腸內(nèi)糞便，用凱氏定氮法測(cè)定糞中粗蛋白含量，用索氏提取法測(cè)定糞中粗脂肪含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用DPS軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并用Ducan’s進(jìn)行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

各組大鼠回腸組織形態(tài)組織結(jié)構(gòu)、消化酶活性和糞便中營(yíng)養(yǎng)素含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，衰老模型組和衰老模型+霍山石斛多糖組的小腸絨毛高度顯著變短(p<0.01)，小腸隱窩深度顯著增加(p<0.01)，小腸絨毛高度：小腸隱窩深度顯著變小(p<0.01)；與衰老模型組相比，衰老模型+霍山石斛多糖組的小腸絨毛高度顯著升高(p<0.01)、小腸隱窩深度顯著降低(p<0.01)，小腸絨毛高度：小腸隱窩深度顯著增加(p<0.01)，表明D-半乳糖誘導(dǎo)的致衰作用對(duì)小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)有不利影響，這種作用可被霍山石斛多糖部分逆轉(zhuǎn)，但仍不能恢復(fù)到正常水平。在小腸消化酶活性上，衰老模型組的蛋白酶活性顯著低于對(duì)照組和衰老模型+霍山石斛多糖組(p<0.01)，但衰老模型+霍山石斛多糖組的蛋白酶活性與對(duì)照組相比，沒(méi)有顯著差異(p>0.05)；衰老模型組的淀粉酶活性顯著低于對(duì)照組和衰老模型+霍山石斛多糖組(p<0.01)，但衰老模型+石斛多糖組的蛋白酶活性與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異(p>0.05)；各組的脂肪酶活性沒(méi)有顯著差異(p>0.05)，說(shuō)明D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老作用對(duì)蛋白酶和淀粉酶活性影響較大，且這種作用基本上可被飼喂石斛多糖阻斷。在糞中粗蛋白含量和粗脂肪含量上，衰老模型組和衰老模型組+霍山石斛多糖組的糞中粗蛋白含量顯著高于對(duì)照組(p<0.01)，衰老模型組糞中粗蛋白含量顯著高于衰老模型+霍山石斛多糖組(p<0.05)；各組大鼠糞中粗脂肪含量沒(méi)有顯著差異(p>0.05)，說(shuō)明D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老增加了糞中蛋白質(zhì)的排出，飼喂石斛多糖對(duì)減少衰老模型大鼠糞中蛋白質(zhì)的排出有一定作用。

表1 大鼠回腸組織形態(tài)組織結(jié)構(gòu)、消化酶活性和糞便中營(yíng)養(yǎng)素含量的測(cè)定結(jié)果(n=10)

注：同一行數(shù)據(jù)標(biāo)有不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05)，標(biāo)有不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

衰老又稱(chēng)老化，通常是指在正常狀況下生物發(fā)育成熟后，隨年齡增加，自身機(jī)能減退，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力與應(yīng)激能力下降，結(jié)構(gòu)、組分逐步退行性變，趨向死亡，不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象[15](P394-396)。生物衰老無(wú)法阻止，但可以延緩。D-半乳糖致衰老模型造模時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、模型易于建成、重復(fù)性好，表現(xiàn)出與自然衰老動(dòng)物相似的衰老體征，已成為國(guó)內(nèi)較公認(rèn)的衰老動(dòng)物模型[16]。增齡可降低小腸絨毛高度，且伴有小腸隱窩數(shù)量的減少，從而導(dǎo)致消化吸收功能減退[17-18]。連續(xù)皮下注射D-半乳糖0.125g·kg-1·d-142d復(fù)制的衰老模型大鼠小腸粘膜厚度及絨毛高度降低，該變化與26月齡自然衰老大鼠腸道老化程度相當(dāng)[19]。因此，本研究用D-半乳糖致衰大鼠模型來(lái)觀(guān)察霍山石斛多糖對(duì)衰老動(dòng)物腸道消化吸收功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，在動(dòng)物模型的選取上是合適的。

本研究發(fā)現(xiàn)給大鼠連續(xù)灌胃200mg·kg-1·BW-1霍山石斛多糖溶液，可以顯著緩解D-半乳糖引起的衰老模型大鼠小腸絨毛高度的降低和隱窩的變深，但不能完全恢復(fù)到對(duì)照組的水平。D-半乳糖也使衰老模型大鼠小腸蛋白酶和淀粉酶活性顯著降低，但霍山石斛多糖可以基本消除這種影響。D-半乳糖對(duì)衰老模型小腸脂肪酶活性影響不明顯。衰老模型大鼠糞中粗蛋白含量顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明衰老模型動(dòng)物對(duì)飼料中的蛋白質(zhì)消化吸收減弱，導(dǎo)致排除的粗蛋白較多。另一種可能是衰老模型大鼠的腸道處于一種低度的炎癥反應(yīng)，有較多的腸上皮細(xì)胞死亡脫落，其分解產(chǎn)物隨糞便一起排出，從而引起糞中粗蛋白水平升高。本研究中衰老動(dòng)物糞便中粗蛋白水平甚至高于飼料中粗蛋白水平，可以支持這種猜測(cè)。三組大鼠糞中粗脂肪含量沒(méi)有顯著差異?；羯绞嗵菍?duì)小腸脂肪酶活性和糞中粗脂肪含量沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明霍山石斛多糖對(duì)衰老模型大鼠的脂肪消化吸收影響不明顯。霍山石斛多糖為何對(duì)粗蛋白和粗脂肪的消化吸收產(chǎn)生不同影響，其原因有待進(jìn)一步探討。

D-半乳糖衰老模型是在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)不斷的注射D-半乳糖，以增高大鼠細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度，并在醛糖還原酶催化作用下，將半乳糖還原成半乳糖醇，后者不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響細(xì)胞的正常滲透壓，并伴隨有大量自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙、代謝紊亂的癥狀，短時(shí)間內(nèi)引起機(jī)體衰老[20]?；羯绞嗵蔷哂休^好的抗氧化作用[4-6]。因此，霍山石斛多糖對(duì)D-半乳糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激的緩解作用可能是霍山石斛多糖的抗衰老機(jī)制之一。

4 結(jié)論

給大鼠連續(xù)灌胃200 mg·kg-1·BW-1霍山石斛多糖溶液，可以改善衰老模型大鼠小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，并對(duì)消化酶活性和營(yíng)養(yǎng)素吸收產(chǎn)生有益影響。該結(jié)果為古人關(guān)于霍山石斛“厚腸胃……輕身延年”的藥理效應(yīng)認(rèn)識(shí)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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