血管活性腸肽抑制帕金森病MPTP模型小鼠紋狀體中核因子-κB p65、腫瘤壞死因子α和單核細(xì)胞趨化蛋白-1的上調(diào)*

呂 娥 劉 飛 李 侃 李曉健 費(fèi)學(xué)超 盧克良

(濰坊醫(yī)學(xué)院,1 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,2 2014級生物醫(yī)學(xué)專業(yè),3 2015級生物醫(yī)學(xué)專業(yè),4 2013級生物醫(yī)學(xué)專業(yè),5 麻醉醫(yī)學(xué)教研室,濰坊 261053)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)主要病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元漸進(jìn)性變性、死亡,導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)DA含量明顯減少。然而,PD的發(fā)病機(jī)制仍不明確。近年來研究表明,神經(jīng)炎癥在PD的發(fā)病中起著至關(guān)重要作用[1]。神經(jīng)炎癥是由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的多種細(xì)胞損傷及其釋放的炎癥介質(zhì)引起的[2],可加劇神經(jīng)變性過程,最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[3]。核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)明顯增加,參與調(diào)節(jié)許多促炎物質(zhì),如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNFα),白介素1(interleukin 1,IL-1)和白介素6(interleukin 6,IL-6)等的轉(zhuǎn)錄[4]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)與PD神經(jīng)炎癥密切相關(guān),可能是炎癥反應(yīng)起始因素中的一個關(guān)鍵因子[5]。血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)是一種具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性的神經(jīng)肽[6]。Mario等[7]及本課題組[8]的研究均表明VIP可抑制中腦黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究旨在通過1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)模型小鼠探討VIP是否通過調(diào)節(jié)NF-κB p65的水平,從而抑制神經(jīng)炎癥,對紋狀體發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

成年雄性C57BL/6小鼠(12～14周齡),體質(zhì)量25～31g,購買于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司(動物合格證號：SCXK魯20140007)。

1.2 主要試劑

MPTP·HCl、VIP、小鼠單克隆酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗體、兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體和兔抗β-actin抗體均購買于美國Sigma公司;兔抗NF-κB p65抗體購買于上海良森生物有限公司;兔抗離子鈣結(jié)合蛋白-1(ionized calcium-binding adaptor molecule-1,Iba1)購自日本和光公司;小鼠來源的TNF-α和MCP-1的酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自武漢CUSABIO公司;生物素-鏈霉卵白素免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購買于北京中杉金橋生物公司;實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器有德國Eppendorf公司紫外可見分光光度計、日本Olympus公司光學(xué)顯微鏡和德國Leica公司冰凍切片機(jī)。

1.3 PD亞急性MPTP小鼠模型的建立和動物分組

將動物隨機(jī)分為生理鹽水對照組(NS組)、MPTP組、MPTP+VIP組,每組8～12只。MPTP組以30mg·kg-1·d-1的劑量給予MPTP腹腔注射,1次/天,共5d。動物適應(yīng)環(huán)境7d后開始實(shí)驗(yàn),記為第1天,開始給予MPTP+VIP組小鼠隔天腹腔注射VIP[6](1.5mg/kg),共8次,NS組和MPTP組給予等體積的生理鹽水腹腔注射。第5次注射VIP結(jié)束后2h,開始MPTP腹腔注射,MPTP組和NS組動物分別腹腔注射MPTP和相應(yīng)體積的生理鹽水,注射5d后各組小鼠水合氯醛麻醉,一部分于冰上快速剝離腦組織,分離出雙側(cè)紋狀體,置于Eppendorf管中,放入液氮速凍,置于-80℃冰箱保存;另一部分采用4%多聚甲醛灌注固定后分離腦組織,用于各種指標(biāo)的檢測。

1.4 免疫組織化學(xué)顯色

腦組織沉糖后,冰凍切片機(jī)將腦組織冠狀切片(30μm),加入通透緩沖液0.3% Triton X-100,室溫孵育30min。0.01mol/L的PBS溶液洗滌,5min×3次。3% H2O2溶液室溫孵育30min,封閉內(nèi)源性過氧化物酶。洗滌后血清工作液,室溫封閉30min后,分別滴加小鼠抗TH抗體(1∶1000),兔抗GFAP抗體(1∶1000)及兔抗Iba-1抗體(1∶500),4℃孵育過夜,參照莊文欣等[7]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),直至脫水、透明和封片,并拍攝照片。用圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0,對各組小鼠紋狀體TH、GFAP和Iba1陽性染色的平均光密度值(optical density,OD)進(jìn)行分析,統(tǒng)計各組小鼠紋狀體的平均OD值與NS組均值比值間的差異。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)

將紋狀體組織于磷酸鹽緩沖液中冰上勻漿,再凍融兩次后,4℃離心,保留上清,按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行TNFα和MCP-1的含量變化的檢測,酶標(biāo)儀讀取450nm波長的吸光度。統(tǒng)計各組紋狀體平均吸光度與NS組均值比值間的差異。

1.6 免疫印跡檢測

將樣品從冰箱取出,準(zhǔn)確稱量。加入RIPA蛋白裂解液充分裂解后,超聲破碎20s后,冰上靜置30min后,4℃,12000r/min,離心10min,收集上清入Eppendorf管中,即為紋狀體蛋白。二喹啉甲酸(bicinchonininc acid,BCA)法蛋白質(zhì)定量后,調(diào)整樣品蛋白濃度并加入凝膠加樣緩沖液,95℃變性5min。而后參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),其中孵育的一抗為兔抗NF-κB p65(1∶1000)或兔抗β-actin(1∶5000)的試管中。用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行條帶平均吸光度(average absorbance,AA)分析,把各組NF-κB p65條帶AA與β-actin條帶AA比值與NS組比值相比較。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 VIP可保護(hù)MPTP小鼠紋狀體TH的水平

免疫組織化學(xué)顯色顯示(圖1A-TH),NS組紋狀體TH陽性神經(jīng)纖維染色呈現(xiàn)為棕色,MPTP組則染色淺淡,MPTP+VIP組紋狀體TH染色明顯較MPTP組深。圖像分析結(jié)果(圖1B)顯示,MPTP組比NS組小鼠減少約60%,MPTP+VIP組比MPTP組增多約40%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,表明給予VIP可改善MPTP誘導(dǎo)的小鼠紋狀體TH水平的降低。

2.2 VIP可減輕MPTP小鼠紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)化和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化

GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物,其免疫組織化學(xué)顯色可檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和激活改變。對紋狀體區(qū)GFAP的免疫組織化學(xué)顯色(圖1A-GFAP)顯示,NS組陽性細(xì)胞胞體小,突起細(xì)而長,染色淺淡。MPTP組陽性細(xì)胞呈現(xiàn)典型的膠質(zhì)化形態(tài),細(xì)胞染色深,胞體變大,突起多而粗,而MPTP+VIP組陽性細(xì)胞較MPTP組染色較淺,突起少而細(xì)。圖像分析結(jié)果(圖1C)顯示,MPTP組比NS組顯著增高(P<0.01),MPTP+VIP組比MPTP組明顯降低(P<0.05)。以上結(jié)果表明,VIP可明顯降低MPTP誘導(dǎo)的小鼠紋狀體區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠質(zhì)化。

Iba1是小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白,其免疫組織化學(xué)顯色可顯示小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和激活狀況。紋狀體區(qū)Iba1免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果(圖1A-Iba1)顯示,NS組小鼠陽性細(xì)胞體積較小,染色淺,突起纖細(xì)且少;MPTP組陽性細(xì)胞聚集成團(tuán),細(xì)胞染色深,體積大,突起短而粗,為明顯的阿米巴樣激活狀態(tài)。MPTP+VIP組陽性細(xì)胞比MPTP組細(xì)胞數(shù)量減少,體積較小,激活狀態(tài)弱。圖像分析(圖1D)顯示,MPTP組比NS組顯著增加(P<0.01),MPTP+VIP組比MPTP組明顯減少(P<0.05)。由以上結(jié)果提示,給予VIP明顯降低MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠紋狀體區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。

圖1 VIP對MPTP小鼠紋狀體區(qū)TH、GFAP和Iba1水平的影響。免疫組織化學(xué)法顯示紋狀體區(qū)TH、GFAP和Iba1的水平(A)。標(biāo)尺=500μm(TH),標(biāo)尺=50μm(GFAP和Iba1)。紋狀體區(qū)TH陽性神經(jīng)纖維(B)、紋狀體區(qū)GFAP(C)和Iba1(D)的平均光密度統(tǒng)計分析(n=4)。**P<0.01vsNS組;△P<0.05vsMPTP組.
Fig 1 Effects of VIP on the levels of TH,GFAP and Iba1 in the striatum of MPTP-induced mice.(A) The levels of TH,GFAP and Iba1 in the striatum by immunohistochemistry.Scale bar=500μm (TH),Scale bar=50μm (GFAP and Iba1).Quantification of the mean OD of TH-positive fibers (B),GFAP (C) and Iba-1 (D) in the striatum (n=4).**P<0.01vsNS group.△P<0.05vsMPTP group.

2.3 VIP可降低MPTP小鼠紋狀體TNFα和MCP-1的含量

ELISA法檢測結(jié)果顯示,與NS組相比,MPTP組小鼠紋狀體TNFα(圖2A)和MCP-1(圖2B)的異常升高,而VIP明顯逆轉(zhuǎn)毒性MPTP導(dǎo)致的炎癥因子TNFα和MCP-1的升高,結(jié)果表明,VIP可顯著降低MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠紋狀體的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

圖2 VIP下調(diào)MPTP小鼠紋狀體TNFα和MCP-1的含量Fig 2 VIP down-regulated the content of TNFα and MCP-1 in the striatum of MPTP-induced miceQuantification of the content of TNF-α (A) and MCP-1 (B) in the striatum by ELISA (n=6).*P<0.05,**P<0.01 vs NS group, △P<0.05,△△P<0.01 vs MPTP group

2.4 VIP可下降MPTP小鼠紋狀體NF-κB p65的水平

用免疫印跡檢測NF-κB p65的水平(圖3A),統(tǒng)計結(jié)果(圖3B)顯示,MPTP組比NS組顯著升高(P<0.05);MPTP+VIP組與MPTP組相比明顯下降(P<0.05),表明VIP可降低MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠紋狀體NF-κB p65水平的異常升高。

圖3 VIP降低MPTP小鼠紋狀體NF-κB p65的水平Fig 3 VIP restrained the level of NF-κB p65 in the striatum of MPTP-induced miceImmunoblot analysis of NF-κB p65/β-actin protein expression in the striatum (A).Quantification of NF-κB p65 (B) levels (n=4).*P<0.05 vs NS group,△P<0.05 vs MPTP group

3 討論

最近的研究表明,炎癥和炎癥性應(yīng)激反應(yīng)是各種神經(jīng)退行性疾病(包括PD)的主要因素[1]。PD患者和神經(jīng)毒性物質(zhì)誘導(dǎo)的PD模型均出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞顯著激活和和星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠質(zhì)化[9]。本實(shí)驗(yàn)中MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠紋狀體也出現(xiàn)明顯的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠質(zhì)化。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞會影響周圍局部組織環(huán)境中炎癥因子,如細(xì)胞因子、趨化因子等的分泌[10]。因子釋放失調(diào)可能是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元損傷的主要原因。有研究顯示,炎癥介質(zhì)在體內(nèi)或體外均可促進(jìn)α-突觸核蛋白的聚集并導(dǎo)致DA的繼發(fā)性神經(jīng)毒性反應(yīng)[11]。因而,有學(xué)者認(rèn)為抑制炎癥在PD模型中發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用,或許對PD患者也發(fā)揮至關(guān)重要的療效[12]。

NF-κB是炎癥發(fā)生過程的重要介質(zhì),可參與調(diào)節(jié)許多炎性物質(zhì)的表達(dá)[4]。在脂多糖誘導(dǎo)的PD大鼠模型中,Sharma等[13]報道NF-κB及TNFα、白介素1等炎性因子在黑質(zhì)DA能神經(jīng)元表達(dá)明顯上調(diào)。趨化因子MCP-1和細(xì)胞因子TNFα在神經(jīng)炎癥中發(fā)揮著重要作用。神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均可產(chǎn)生MCP-1,可以調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的趨化性[5]。PD患者外周血MCP-1水平比健康對照組受試者明顯增高,且與患者的認(rèn)知功能和抑郁狀況密切相關(guān)[14]。黑質(zhì)中腦DA能神經(jīng)元對具有促炎作用的細(xì)胞因子TNFα非常敏感[15],PD患者腦脊液和尸檢腦組織均顯示TNFα水平升高[16]。本實(shí)驗(yàn)中,給予神經(jīng)毒素MPTP后,紋狀體NF-κB p65、MCP-1和TNFα均明顯上升,與文獻(xiàn)[13-16]報道結(jié)果一致。

PD作為一種慢性、進(jìn)行性和多因素神經(jīng)系統(tǒng)疾病,目前尚無令人滿意的治療手段,如能發(fā)現(xiàn)具有對抗神經(jīng)免疫炎癥和氧化應(yīng)激等多靶點(diǎn)的小分子物質(zhì),從而可以保護(hù)DA能神經(jīng)元,延緩疾病的惡化,有可能從根本上解決PD治療這一醫(yī)學(xué)難題。Dogrukol-Ak等[17]研究表明,VIP可以在外周給藥后,經(jīng)由跨膜擴(kuò)散系統(tǒng)通過血腦屏障,無需酶的降解。在體外和大鼠體內(nèi)研究已顯示VIP具有對抗6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)[18]和MPTP[7]的氧化作用。在MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型中,通過腦內(nèi)或外周給予VIP可阻止在黑質(zhì)和紋狀體中小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥,并減少多巴胺能的丟失[19]其保護(hù)機(jī)制可能是通過降低細(xì)胞因子等的反應(yīng)而發(fā)揮抗炎作用[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,VIP可緩解MPTP損傷導(dǎo)致的紋狀體區(qū)TH的減少,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活,與上述文獻(xiàn)報道一致。進(jìn)一步研究顯示,VIP可減少M(fèi)PTP誘導(dǎo)的紋狀體TNF-α和MCP-1的分泌,并降低NF-κB p65的激活。

綜上所述,VIP可改善MPTP誘導(dǎo)的小鼠紋狀體TH的減少,明顯降低小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化,減少TNFα和MCP-1的分泌,其機(jī)制可能是VIP通過抑制 NF-κB p65的水平從而降低TNFα和MCP-1的異常升高,減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng),從而緩解對紋狀體的神經(jīng)損傷。通過本次初步研究,為進(jìn)一步探討VIP可能成為治療PD潛在藥物的作用機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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