甘氨酸對脂多糖刺激引起的斷奶仔豬腸道能量代謝紊亂的影響

余 程， 王秀英， 吳歡聽， 張 琳， 劉玉蘭， 汪文俊*

（1.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430074；2.武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實驗室，湖北武漢430023）

腸道是重要的消化、吸收器官，也是機(jī)體重要的免疫器官，在免疫應(yīng)激中最易受損（李爽，2013）。脂多糖（LPS）可刺激免疫系統(tǒng)，造成免疫應(yīng)激（劉玉蘭等，2008）。研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激可造成胃腸道蠕動減慢，腸黏膜缺血和缺氧（劉堅等，2009）。此外，LPS刺激可導(dǎo)致機(jī)體釋放過量的炎性細(xì)胞因子，產(chǎn)生大量的自由基，造成脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而這些變化會破壞線粒體結(jié)構(gòu)完整性和細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)，阻礙呼吸鏈的電子傳遞，造成ATP合成障礙，使腸道能量代謝紊亂（李爽，2013；劉堅等，2009）。

甘氨酸（Gly）在傳統(tǒng)氨基酸分類上是一種非必需氨基酸，研究表明，日糧中添加Gly對機(jī)體的發(fā)育起著重要作用，是保證哺乳動物最大生長速率的條件性必需氨基酸（Wu等，2013）。仔豬日糧中添加Gly對提高采食量，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力以及維持腸道完整性有重要意義（Wu等，2013）。Gly可抑制鈣蛋白酶的活性，保護(hù)細(xì)胞免受三磷酸腺苷（ATP）衰竭的影響（谷俊朝等，2005）。 另外，Gly分解后可生成乙酰輔酶A，進(jìn)一步參與三羧酸（TCA）循環(huán)（王鏡巖等，2002）。目前關(guān)于Gly對腸道能量代謝影響的研究報道較少。本試驗通過給斷奶仔豬注射LPS建立腸道損傷模型（劉玉蘭等，2008），研究日糧中添加Gly對腸道能量代謝水平和LPS刺激導(dǎo)致腸道損傷的影響。

1 材料及方法

1.1 試驗材料 Gly和丙氨酸純度均大于99.5%，購自武漢阿米諾科技有限公司。LPS（大腸桿菌血清型055∶B5）購自Sigma公司，溶于生理鹽水，以100μg/kg BW劑量注射。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理 選擇24頭健康、體況相近 （7.17±0.41）kg的杜×長×大斷奶仔豬[（21±1）d 日齡斷奶]，根據(jù)體重相近的原則隨機(jī)分為4個處理組，每組6頭豬。飼養(yǎng)周期35 d，預(yù)試7 d待仔豬適應(yīng)試驗日糧后，進(jìn)行正式試驗。試驗前的驅(qū)蟲及消毒等程序根據(jù)豬場飼養(yǎng)管理規(guī)范進(jìn)行。飼養(yǎng)過程中，仔豬可自由飲水采食。豬舍溫度維持25～27℃。

1.3 試驗飼糧和設(shè)計 參照NRC（1998）仔豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制基礎(chǔ)日糧，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。在各組飼糧中添加丙氨酸以達(dá)到等氮。本試驗分為4個處理組，分別為對照組、LPS組、1.0%Gly組和2.0%Gly組。對照組和LPS組飼喂基礎(chǔ)日糧，后兩組飼喂分別添加了1.0%Gly和2.0%Gly的日糧。正式試驗第28天時，LPS組、1.0%Gly組和2.0%Gly組仔豬注射LPS，對照組注射相同劑量生理鹽水。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.4 腸道樣品采集與處理 注射LPS或生理鹽水4 h后，仔豬注射戊巴比妥鈉，待充分麻醉后進(jìn)行屠宰，剖開腹腔取空腸和回腸樣品置于冰上。剖開小腸，用4℃生理鹽水沖洗腸段。待濾紙充分吸干水分后，用載玻片刮取空腸和回腸黏膜，分裝至離心管中，凍存待測。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 腺苷酸含量的測定 腸道的樣品參照李爽（2013）的方法進(jìn)行前處理，采用反向高效液相色譜系統(tǒng)測定樣品中ATP、二磷酸腺苷（ADP）和一磷酸腺苷（AMP）的濃度，標(biāo)準(zhǔn)品也在相同的色譜條件下測定。通過標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的峰面積和濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，根據(jù)所測樣品的峰面積計算腸道三種腺苷酸（ATP、ADP和 AMP）含量，以 μg/g黏膜重表示。腺苷酸池（TAN）和能荷（EC）水平的計算參照下述公式（李爽，2013）：

TAN=ATP+ADP+AMP；

EC=（ATP+1/2ADP）/（ATP+ADP+AMP）。

1.5.2 TCA循環(huán)關(guān)鍵酶活性的測定 TCA循環(huán)關(guān)鍵酶包括檸檬酸合成酶（CS）、異檸檬酸脫氫酶（ICDH） 和 α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體 （α-KGDHC），其酶含量的測定方法與李爽（2013）一致，采用ELISA法進(jìn)行測定。

1.5.3 能量代謝相關(guān)因子mRNA表達(dá)量的測定測定的基因包括腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirt1）、過氧化物酶體增殖物受體-α 輔激活因子1α（PGC-1α）。組織總 RNA提取、cDNA合成、Real-time PCR參照李爽（2013）的方法。待測基因及內(nèi)參基因GAPDH的引物見表2。所測基因的mRNA表達(dá)量采用2-ΔΔCT計算（Livak 和 Schmittgen，2001）。

表2 基因的引物序列

1.6 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較。統(tǒng)計結(jié)果用平均值和SEM表示。P≤0.05表示顯著差異，0.05＜P≤0.10表示具有差異顯著性趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 Gly對LPS刺激仔豬腸道能量代謝指標(biāo)的影響 由表3可知，與對照組相比，LPS刺激導(dǎo)致空腸ATP含量、TAN和EC水平分別下降44.5%、21.2%、19.4%，AMP/ATP比值升高96.1%，回腸ATP、ADP含量和 TAN水平降低21.9%、12.9%、18.0%（P ＜0.05）。 與 LPS組相比，1.0%Gly使空腸TAN水平提高14.9%（P=0.05），有升高空腸AMP含量的趨勢 （P＜0.10）；2.0%Gly有提高空腸ATP含量和EC水平的趨勢（P＜0.10）。

表3 Gly對LPS刺激仔腸道臟能量代謝指標(biāo)的影響（以濕重為基礎(chǔ)）

2.2 Gly對LPS刺激仔豬腸道TCA循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響 由表4可知，與對照組相比，LPS刺激導(dǎo)致空腸 TCA循環(huán)關(guān)鍵酶 CS、ICDH和 α-KGDHC的活性分別降低15.0%、13.2%、23.2%，回腸TCA循環(huán)關(guān)鍵酶CS、ICDH和α-KGDHC的活性分別降低 24.3%、23.5%、51.8%（P＜0.05）。1.0%Gly有提高回腸α-KGDHC活性的趨勢（P＜0.10）；2.0%Gly使空腸 ICDH和回腸 α-KGDHC活性分別提高15.9%和41.3%（P＜0.05），同時有提高回腸CS活性的趨勢（P＜0.10）。

2.3 Gly對LPS刺激仔豬腸道能量代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 由表5可知，與對照組相比，LPS刺激導(dǎo)致空腸 PGC-1α、回腸 Sirt1和PGC-1α的mRNA表達(dá)量分別降低55.0%、18.0%、55.0%（P ＜ 0.05）。 與 LPS組相比，1.0%Gly使空腸 PGC-1α的mRNA表達(dá)水平提高64.4%（P ＜ 0.05）；2.0%Gly使空腸 PGC-1α、回腸Sirt1和PGC-1α的mRNA表達(dá)水平分別提高51.1%、22.0%、60.0%（P ＜ 0.05）。

表4 Gly對LPS刺激仔豬腸道TCA循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響（以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)）

表5 Gly對LPS刺激仔豬腸道能量代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

3 討論

ATP是細(xì)胞的重要供能物質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)ATP與ADP可相互轉(zhuǎn)換，進(jìn)而維持ATP的動態(tài)平衡，持續(xù)地為細(xì)胞提供能量（王鏡巖等，2002）。另外，細(xì)胞中ATP、ADP和AMP含量的動態(tài)變化可調(diào)控細(xì)胞的代謝過程（王鏡巖等，2002）。TAN為三種腺苷酸之和，是描述細(xì)胞代謝和能量儲備狀態(tài)的重要參數(shù)（楊震國等，2012）。為了衡量細(xì)胞中高能磷酸鍵的多少，1968年Atkinson提出了EC的概念，EC可動態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量平衡（楊震國等，2012）。

本試驗中，LPS刺激導(dǎo)致腸道ATP和ADP含量、TAN和EC水平下降，AMP/ATP比值升高，表明LPS刺激阻礙了腸黏膜的能量代謝。劉堅等（2009）研究表明，LPS刺激后腸上皮細(xì)胞ATP分解代謝增強(qiáng)，加劇了腸道能量供應(yīng)不足；Bradley（1979）發(fā)現(xiàn)LPS自身及其介導(dǎo)的腸道黏膜組織缺血缺氧和過氧化損傷會破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)的完整性，抑制氧化磷酸化相關(guān)酶如ATP合成酶和電子傳遞鏈中相關(guān)酶如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脫氫酶的活性，進(jìn)而減少ATP合成，導(dǎo)致機(jī)體能量代謝紊亂。本試驗結(jié)果顯示，日糧中添加Gly提高了空腸ATP和AMP含量、TAN和EC水平。Wu等（2013）發(fā)現(xiàn)飼糧中約30%的Gly在幼齡仔豬小腸的首過代謝中被降解產(chǎn)能。有研究表明，Gly可通過斯提柯蘭氏反應(yīng)產(chǎn)生乙酸，給宿主特別是腸道上皮細(xì)胞提供能量（朱偉云等，2014）。因此，我們推測Gly可被機(jī)體利用產(chǎn)能，緩解LPS刺激導(dǎo)致的仔豬腸道能量不足。

TCA是需氧生物體重要的能量生成途徑，機(jī)體對ATP的需求決定了TCA循環(huán)的速率 （王鏡巖等，2002）。 CS、ICDH 和 α-KGDHC 是 TCA 循環(huán)中的三種關(guān)鍵限速酶，均存在真核細(xì)胞的線粒體中 （王鏡巖等，2002）。CS是TCA循環(huán)的第一個關(guān)鍵限速酶，可催化乙酰輔酶A生成檸檬酸，調(diào)控生物體的能量代謝 （史紅超和蘇鐵柱，2011）。ICDHs可依據(jù)輔酶分為 NAD-ICDH和NADP（酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）-ICDH，催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸 （史紅超和蘇鐵柱，2011）。α-KGDHC是TCA中一個關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)，可催化α-酮戊二酸生成琥珀酰輔酶A（王鏡巖等，2002）。

本試驗中，LPS刺激導(dǎo)致TCA循環(huán)三種限速酶的活性下降，這與李爽（2013）的研究結(jié)果類似。本試驗結(jié)果顯示，Gly能顯著提高腸道TCA循環(huán)三種限速酶的活性，表明Gly能提高TCA循環(huán)的反應(yīng)速率，使機(jī)體獲得更高的能量供給。有研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激產(chǎn)生的自由基可造成TCA循環(huán)酶的氧化損傷（Kowaltowski和 Vercesi，1999），而 Gly具有抗氧化能力，可清除腸道的自由基 （杜瑞平等，2015）。因此，我們猜測Gly可能通過清除LPS刺激產(chǎn)生的自由基，進(jìn)而對TCA循環(huán)限速酶起保護(hù)作用，最終改善腸道的結(jié)構(gòu)和功能。此外，Gly也可能在機(jī)體內(nèi)分解生成乙酰輔酶A進(jìn)而激活CS，促進(jìn)TCA循環(huán)（史紅超和蘇鐵柱，2011；王鏡巖等，2002）。

AMPK是細(xì)胞能量變化的感受器，當(dāng)機(jī)體缺乏能量或營養(yǎng)時，AMP/ATP比值上升，AMPK被磷酸化激活，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)信號通路使能量恢復(fù)至正常水平（王艷等，2013）。AMPK激活后可提高NAD+水平進(jìn)而影響Sirt1的活性（王艷等，2013）。Sirt1屬于去乙酰化酶（Sirtuin）家族，可促進(jìn)糖異生和脂代謝以及調(diào)控胰島β細(xì)胞分泌胰島素來增加機(jī)體ATP的含量 （趙靜姝和王蓉，2011）。Sirt1也可催化PGC-1α脫乙酰而使其激活（趙靜姝和王蓉，2011）。PGC-1α是一種與能量代謝密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄輔激活因子，能通過增強(qiáng)細(xì)胞呼吸率和利用能量底物產(chǎn)生能量進(jìn)而使細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境的改變（李博等，2011）。

本試驗中，LPS刺激顯著降低Sirt1和PGC-1α的mRNA表達(dá)量，這與Kang等（2015）的結(jié)果類似。本試驗結(jié)果顯示，Gly緩解了LPS刺激導(dǎo)致的Sirt1和PGC-1α的mRNA表達(dá)量的降低。Gly可能通過直接或者間接調(diào)節(jié)Sirt1和PGC-1α，從而提高機(jī)體產(chǎn)能。試驗中LPS刺激和Gly的添加對腸道AMPKα1和AMPKα2的mRNA表達(dá)量均無顯著影響。研究表明，細(xì)胞中ATP含量降低，上升的AMP達(dá)到一定水平，才能激活A(yù)MPK的活性（王艷等，2013；Wijesekara 等，2006），而本試驗中可能是因為仔豬腸道能量變化沒有達(dá)到AMPK的感受范圍，所以其表達(dá)量無顯著變化。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，Gly可緩解LPS刺激導(dǎo)致的腸道能量代謝紊亂，降低TCA循環(huán)關(guān)鍵酶活性以及Sirt1和PGC-1α的mRNA表達(dá)量。

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