正交試驗(yàn)優(yōu)化余甘子愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基研究

黃 勇，張 鐵，沈尚東

（文山學(xué)院，云南 文山 663099）

余甘子（Phyllanthus emblica L.）系大戟科（Euphorbiaceae）葉下珠屬（Phyllanthus）喬木。分布于印度、斯里蘭卡、中南半島、印度尼西亞、馬來(lái)西亞、菲律賓等，南美也有栽培。我國(guó)產(chǎn)于江西、福建、臺(tái)灣、廣東、海南、廣西、四川、貴州、云南等南方省（區(qū)）。余甘子用途廣泛。其根系發(fā)達(dá)，可保持水土，可作產(chǎn)區(qū)荒山荒地酸性土造林的先鋒樹種。樹姿優(yōu)美，可作庭園風(fēng)景樹，亦可作為果樹栽培。果實(shí)富含豐富的丙種維生素，供食用，可生津止渴，潤(rùn)肺化痰，治咳嗽、喉痛，解河豚魚中毒等。初食味酸澀，良久乃甘，故名“余甘子”。樹根和葉可供藥用，能解熱清毒，治皮炎、濕疹、風(fēng)濕痛等。葉曬干供枕芯用料。種子含油量16%，供制肥皂。樹皮、葉、幼果可提制栲膠。木材棕紅褐色，堅(jiān)硬，結(jié)構(gòu)細(xì)致，有彈性，耐水濕，供農(nóng)具和家具用材，又為優(yōu)良的薪炭柴［1］。

余甘子良種苗木多采用嫁接的方法進(jìn)行無(wú)性繁殖，扦插繁殖不理想［2］。組織培養(yǎng)是植物快速繁殖的最佳途徑，但國(guó)內(nèi)外對(duì)余甘子組織培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道很少。Sehgal-CB等［3-4］用胚乳誘導(dǎo)出胚狀體，形成三倍體小苗，但小苗移植死亡率較高。Parul等［5］用下胚軸誘導(dǎo)出不定芽，但不定芽生根非常困難。Rahman MM等［6］用莖尖和節(jié)間誘導(dǎo)出叢生芽，但叢生芽生根率很低。張守英等［7-8］成功誘導(dǎo)嫩芽、嫩枝形成叢生芽，但生根率和移栽存活率都不高。胡海濤等［9-10］用下胚軸誘導(dǎo)出不定芽，生根率也不高。植物組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)中，愈傷組織誘導(dǎo)至關(guān)重要，既可進(jìn)一步誘導(dǎo)器官分化形成組培苗，又可直接從愈傷組織中提取次生代謝產(chǎn)物。我們通過(guò)混合正交設(shè)計(jì)，以期篩選出余甘子愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，完善余甘子組織培養(yǎng)方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生余甘子種子，購(gòu)自文山市綜合市場(chǎng)。

1.2 研究方法

1.2.1 種子無(wú)菌萌發(fā) 將余甘子種子沖洗干凈，置75%酒精中漂洗30 s，無(wú)菌水沖洗3次，1 g/kg HgCl2滅菌10 min，無(wú)菌水沖洗5次。接種于1/2 MS+蔗糖25 g/L+瓊脂6 g/L，pH為5.8的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)在溫度為25℃、光照強(qiáng)度為2 000 lx、光周期為12 h條件下。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo) 種子萌發(fā)后，分別取無(wú)菌幼苗的根、莖、葉接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L，pH為5.8。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑采用混合正交設(shè)計(jì)（表1）。

表1 余甘子愈傷組織誘導(dǎo)混合正交設(shè)計(jì)

如表1所示，共25個(gè)處理，每處理接種12瓶，每瓶接種3～4個(gè)外植體。置溫度為25℃、光照強(qiáng)度為2 000 lx、光周期為12 h培養(yǎng)室中培養(yǎng)。觀察外植體生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織生長(zhǎng)情況

不同外植體在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況有所差異，有的未形成愈傷組織。形成愈傷組織的情況如表2所示。

表2 余甘子愈傷組織生長(zhǎng)情況

從愈傷組織產(chǎn)生速度和顏色來(lái)看，莖和葉是誘導(dǎo)余甘子形成愈傷組織較好的外植體（圖1），而根的效果不佳。

圖1 余甘子葉（左）和莖（右）愈傷組織生長(zhǎng)情況

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)率極差分析

各處理愈傷組織誘導(dǎo)率有較大差異，結(jié)果如表3所示。

從表3極差的R大小可以看出，2，4-D＞外植體＞6-BA，說(shuō)明對(duì)誘導(dǎo)余甘子形成愈傷組織影響最大的因素是2，4-D，其次是外植體，然后是6-BA。

從表3均值K的大小可以看出，對(duì)于6-BA來(lái)說(shuō)，均值K從大到小依次為K3、K4、K1、K2、K5，說(shuō)明隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，余甘子愈傷組織誘導(dǎo)率總體表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，最佳質(zhì)量濃度為0.50 mg/L；對(duì)于2，4-D來(lái)說(shuō)，不添加2，4-D未能誘導(dǎo)出愈傷組織，均值K從大到小依次為 K3、K4、K5、K2、K1，表明隨著 2，4-D質(zhì)量濃度的增加，余甘子愈傷組織誘導(dǎo)率表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，最佳質(zhì)量濃度為1.00 mg/L；對(duì)于外植體來(lái)說(shuō)，均值K從大到小依次為K2、K3、K1，即莖的愈傷組織誘導(dǎo)率最高、葉次之、根最低，說(shuō)明應(yīng)選用莖或葉作為誘導(dǎo)余甘子愈傷組織的外植體。

2.3 愈傷組織誘導(dǎo)率方差分析

運(yùn)用SPSS軟件對(duì)影響余甘子愈傷組織誘導(dǎo)率的因素進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 余甘子愈傷組織誘導(dǎo)極差分析

表4 余甘子愈傷組織誘導(dǎo)率顯著性檢驗(yàn)①

從表4可以看出，6-BA、2，4-D、外植體三者的Sig值均為0，小于0.01，表明6-BA、2，4-D、外植體對(duì)余甘子愈傷組織誘導(dǎo)率均具有極顯著的影響。

3 小結(jié)與討論

以余甘子無(wú)菌幼苗作為試驗(yàn)材料，通過(guò)正交試驗(yàn)研究余甘子愈傷組織誘導(dǎo)影響因素。結(jié)果表明，以莖或葉作為外植體，在MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)87.9%以上，愈傷組織生長(zhǎng)良好。

愈傷組織誘導(dǎo)是植物組織培養(yǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，誘導(dǎo)率的高低受很多因素的影響。一是外植體的選擇。從本試驗(yàn)結(jié)果看，莖和葉是較好的外植體。二是激素的質(zhì)量濃度和組合。一般而言，適宜質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)素是決定因素，而適宜質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素有一定的促進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)

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