鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）對黑腹果蠅生長發(fā)育及繁殖的影響

李 潔，王建福，馬玲玲，邱國斌，劉 珽

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）等鄰苯二甲酸酯類（PAEs）是塑料工業(yè)使用最廣泛、品類最多、產(chǎn)量最大的增塑劑，在塑料、建筑材料、服裝、化妝品、醫(yī)藥品、食品包裝材料乃至兒童玩具中均有使用［1］。DMP與多種樹脂都有很強(qiáng)的溶解力，可與多種纖維素樹脂、橡膠、乙烯基樹脂相溶，有良好的成膜性、粘著性和防水性［2］。同時(shí)，DMP還可用作驅(qū)蚊油（原油）、聚氟乙烯涂料、過氧化甲乙酮等的溶劑。伴隨塑料制品的生產(chǎn)、使用和廢棄，DMP可不斷地釋放出來，進(jìn)入環(huán)境和生物體，造成潛在的危害。美國國家環(huán)境保護(hù)局列出6種PAEs類化合物作為重點(diǎn)污染物，DMP位列之首，DMP等鄰苯二甲酸酯類也被列為中國環(huán)境水中優(yōu)先控制污染物黑名單［3］。劉慧杰等［4］、胡曉宇等［5］研究表明，PAEs具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，對生物生長發(fā)育具有一定毒性。周科等［6］研究發(fā)現(xiàn)，DMP對鯉魚肝細(xì)胞造成了一定的損傷，肝臟合成酶也隨之受到影響。但DMP對果蠅生殖功能和遺傳突變的報(bào)道較少。果蠅是真核多細(xì)胞生物，也是一種經(jīng)典模式生物，作為試驗(yàn)動物，具有飼養(yǎng)容易、生存周期短、繁殖能力強(qiáng)和反應(yīng)靈敏等特點(diǎn)，其代謝系統(tǒng)、生理功能和生長發(fā)育同哺乳動物有許多相似之處。在25℃左右10 d即可繁殖1代，1只雌性果蠅1次能繁殖近百只，可在較短時(shí)間得出結(jié)論。我們從果蠅蛹化率、羽化率、產(chǎn)卵時(shí)間、蛹化時(shí)間、羽化時(shí)間和果蠅繁殖數(shù)量6個方面探討了DMP對果蠅生長發(fā)育和繁殖的影響，以期對評估塑料污染和含PAEs材料制品對人類健康的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試動物

試驗(yàn)指示動物為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院遺傳實(shí)驗(yàn)室提供的黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）。

1.2 試驗(yàn)材料及設(shè)備

1.2.1 材料 玉米粉、白砂糖、瓊脂（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）、酵母浸粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、丙酸（天津市凱信化工業(yè)有限公司）、鄰苯二甲酸二甲酯（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）、蔗糖脂肪酸酯（乳化劑，食品級，柳州愛格富食品科技股份有限公司）、乙醚。

1.2.2 設(shè)備 RXZ型智能人工氣候箱（寧波市儀器廠制造）、XH-B型漩渦混勻器（姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司）、YXQ-LS-SH全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海博訊試業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、移液器（TopPette）、萬用電爐（北京永興儀器有限公司）、體視顯微鏡（Motic，廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）、培養(yǎng)瓶（30mL）、燒杯（50、100、1 000 mL）、麻醉瓶、撥針、玻璃棒、記號筆。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2016年6—12月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室完成。

基本培養(yǎng)基配制：將玉米粉56 g、白砂糖44 g、瓊脂粉5 g溶解于150 mL蒸餾水并攪拌均勻，然后用電爐邊加熱邊攪拌至煮沸呈粘稠狀，冷卻5 min后加入酵母粉5 g、丙酸3 mL，邊攪拌邊裝瓶，每瓶培養(yǎng)基厚度為0.5～1.0 cm。1份基本培養(yǎng)基分裝12～15瓶。

染毒培養(yǎng)基配制：用移液器量取0、0.1、0.5、2.5、7.5 mL DMP標(biāo)準(zhǔn)液，分別添加到100 mL乳化劑（含2%蔗糖脂肪酸酯）中稀釋，并用漩渦混勻器充分混勻，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、0.1%、0.5%、2.5%、7.5%的DMP應(yīng)用液。將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的DMP應(yīng)用液加入基本培養(yǎng)基并攪拌均勻，裝入培養(yǎng)瓶中，每瓶培養(yǎng)基厚度為0.5～1.0 cm，制成DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.1%、0.5%、2.5%、7.5%的染毒培養(yǎng)基。以基本培養(yǎng)基作為對照組，每組均設(shè)5個重復(fù)。

1.4 測定方法

1.4.1 蛹化和羽化測定 將未交配的雌雄黑腹果蠅放入基本培養(yǎng)基中使其交配產(chǎn)卵12 h，然后將成蟲倒出。把含有卵的培養(yǎng)基放入智能人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，在12 h內(nèi)收集一齡幼蟲并放到含有不同濃度組的DMP染毒培養(yǎng)基中飼喂，每個培養(yǎng)瓶中放一齡幼蟲20只。從放入一齡幼蟲到培養(yǎng)基中出現(xiàn)蛹化時(shí)計(jì)時(shí)，每2 h觀察記錄蛹化時(shí)間及蛹化數(shù)。蛹化全部完成后每2 h觀察并記錄羽化時(shí)間，記錄新產(chǎn)生的羽化數(shù)，直至成蠅不再出現(xiàn)。

1.4.2 產(chǎn)卵時(shí)間測定 取未交配的黑腹果蠅50只，雌雄各半。用乙醚淺度麻醉后隨機(jī)配對25組，分別放入DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.1%、0.5%、2.5%、7.5%的培養(yǎng)基中飼喂，每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度設(shè)置5組平行培養(yǎng)基，每瓶有1雌1雄共2只果蠅，觀察其生長情況。從放入未交配的果蠅開始計(jì)時(shí)，每2 h觀察記錄1次，瓶壁上出現(xiàn)約0.5 mm的橢圓形白色小點(diǎn)則表明開始產(chǎn)卵，從計(jì)時(shí)到開始產(chǎn)卵的時(shí)間段為產(chǎn)卵時(shí)間。每對果蠅培養(yǎng)7 d后，轉(zhuǎn)移至含相同培養(yǎng)基的果蠅瓶（新瓶）中培養(yǎng)，依照以上步驟培養(yǎng)3次。

1.4.3 繁殖量測定 隨機(jī)挑選飼喂基本培養(yǎng)基上的未交配果蠅，雌雄各半，放到不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的DMP染毒培養(yǎng)基上飼喂，每1質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度設(shè)置5瓶重復(fù)，每瓶有1雌1雄共2只作為親本。每對親本果蠅培養(yǎng)7 d后，轉(zhuǎn)移至含相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（新瓶）中培養(yǎng)，移除親本后的培養(yǎng)瓶（原瓶）繼續(xù)培養(yǎng)。7 d后移除親本的培養(yǎng)瓶（原瓶）中出現(xiàn)的F1代果蠅，連續(xù)7 d統(tǒng)計(jì)羽化數(shù)量，計(jì)為其1期繁殖數(shù)量。轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶（新瓶）繼續(xù)培養(yǎng)親本，在新瓶中培養(yǎng)7 d后做同上處理，計(jì)為第2期繁殖數(shù)量。重復(fù)以上步驟，統(tǒng)計(jì)第3期繁殖數(shù)量（以7 d記錄為1個周期，共研究3個周期即 21 d）。

2 結(jié)果與分析

2.1 DMP對黑腹果蠅生長發(fā)育的影響

從表1可以看出，隨著DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，黑腹果蠅的蛹化數(shù)呈先增加后降低的趨勢，但2.5%以下的DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)組差異并不顯著（P＞0.05），DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%組的蛹化數(shù)顯著低于0.1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)組（P＜0.05）。隨著DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，黑腹果蠅的羽化數(shù)有逐漸下降的趨勢，但2.5%以下的DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)組差異并不顯著（P＞0.05），7.5%組的羽化數(shù)顯著低于對照組和0.1%組（P＜0.05）。

表1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)DMP對黑腹果蠅一齡幼蟲蛹化和羽化的影響①

2.2 DMP對黑腹果蠅繁殖的影響

2.2.1 DMP對黑腹果蠅產(chǎn)卵時(shí)間的影響 由表2可以看出，3期黑腹果蠅的平均產(chǎn)卵時(shí)間均在DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%時(shí)最遲。第1期平均產(chǎn)卵時(shí)間在0.1%時(shí)最早，與除2.5%組以外的其他各組差異顯著（P＜0.05），對照組與0.5%、2.5%、7.5%組的產(chǎn)卵時(shí)間無顯著差異（P＞0.05）；第2期平均產(chǎn)卵時(shí)間在DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%時(shí)最早，與除對照組以外的其他各組差異顯著（P＜0.05），0.5%組的產(chǎn)卵時(shí)間顯著遲于0.1%組和對照組（P＜0.05），同時(shí)也顯著早于7.5%組（P＜0.05），但與2.5%組差異不顯著（P＞0.05）；第3期平均產(chǎn)卵時(shí)間在DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)最早，但其與除7.5%組之外的其他各組差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)DMP處理黑腹果蠅的平均產(chǎn)卵時(shí)間 d

2.2.2 DMP對黑腹果蠅繁殖數(shù)的影響 從表3可以看出，3期黑腹果蠅的平均繁殖數(shù)均表現(xiàn)出隨著DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而先增加后降低的趨勢。第1期平均繁殖數(shù)在DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)最高，顯著高于除0.1%組以外的其他各組（P＜0.05）；7.5%組的平均繁殖數(shù)最低，顯著低于其他各組（P＜0.05）。第2期平均繁殖數(shù)在DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)最高，顯著高于除0.1%組以外的其他各組（P＜0.05）；7.5%組的平均繁殖數(shù)最低，顯著低于其他各組（P＜0.05）。第3期平均繁殖數(shù)在DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)最高，顯著高于其他各組（P＜0.05）。從圖1可以看出，第2期繁殖的個體與正常果蠅對比形態(tài)發(fā)生了變化，有白體、殘翅和瘦小等癥狀（b、c左為正常），部分伴有畸形，如腹部彎曲、細(xì)尖，背部腫脹突起。據(jù)此推測DMP可能對果蠅的生長發(fā)育有致畸性的影響。

表3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)DMP處理的黑腹果蠅繁殖數(shù) 只

3 結(jié)論與討論

鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）對黑腹果蠅的生長發(fā)育具有一定的抑制作用，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的抑制作用更為明顯。隨著鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，黑腹果蠅的繁殖性能表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的DMP可能對黑腹果蠅具有一定的致畸作用，但仍需進(jìn)一步證實(shí)。

劉慧杰等［4］、胡曉宇等［5］的研究表明，鄰苯二甲酸酯類（PAEs）具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，對生物的生長發(fā)育具有一定的毒性。另外，有研究表明，鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）對細(xì)菌、藻類和馬鈴薯的生長均有明顯的抑制作用，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高其抑制作用隨之增強(qiáng)［7-10］。隨著DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，馬鈴薯可溶性蛋白含量呈下降趨勢，使馬鈴薯的生長受阻。鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）也可使細(xì)菌的形態(tài)發(fā)生變化，對菌體變長的影響與本文對果蠅形態(tài)的研究結(jié)論相似。

圖1 第2期黑腹果蠅繁殖個體比較

用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）處理后的培養(yǎng)基飼喂的黑腹果蠅，其蛹化數(shù)和羽化數(shù)表現(xiàn)出降低的趨勢，尤其在7.5%的高質(zhì)量分?jǐn)?shù)組下降明顯，可見鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）對黑腹果蠅的生長發(fā)育具有抑制效應(yīng)，且高質(zhì)量分?jǐn)?shù)組的抑制效應(yīng)更明顯。高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）對黑腹果蠅產(chǎn)卵時(shí)間有明顯的延遲作用，而低質(zhì)量分?jǐn)?shù)組則影響較小。隨著鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，本試驗(yàn)中黑腹果蠅繁殖數(shù)量先升高后降低，這與藺琰東等［10］馬鈴薯組培苗SOD活性呈升后降的變化趨勢的結(jié)論一致。隨著飼喂培養(yǎng)基鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，0.1%組和0.5%組與對照組相比，黑腹果蠅的繁殖數(shù)量逐漸增多；2.5%組和7.5%組與對照組相比黑腹果蠅的繁殖數(shù)逐漸減少，此結(jié)果與徐曼妮等［11］利用鄰苯二甲酸二丁酯處理果蠅的結(jié)果一致?？赡苁堑唾|(zhì)量分?jǐn)?shù)的鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）有促進(jìn)黑腹果蠅繁殖的效應(yīng)，而高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）又會抑制這種效應(yīng)，其具體的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步從生理生化指標(biāo)變化以及分子水平上做深入研究。從3期培養(yǎng)黑腹果蠅的繁殖數(shù)量上來看，第2期繁殖數(shù)量最多，第3期繁殖數(shù)量則明顯降低，可能與親本果蠅的老年化有關(guān)。在試驗(yàn)觀察過程中還發(fā)現(xiàn)，第2期和3期培養(yǎng)的黑腹果蠅還出現(xiàn)了白體、殘翅和瘦小等異常癥狀的個體，部分個體還出現(xiàn)了腹部彎曲、細(xì)尖，背部腫脹突起等畸形，并且隨著DMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，異常個體和畸形個體出現(xiàn)了增多的趨勢，推測高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）可能對黑腹果蠅有一定的致畸作用，但仍需要做進(jìn)一步的驗(yàn)證性研究。

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