聚谷氨酸生物的合成及其在修復(fù)和改良土壤中的應(yīng)用

張 宸

(1.陜西省土地工程建設(shè)集團(tuán)有限責(zé)任公司， 陜西 西安 710075；2. 陜西地建土地工程技術(shù)研究院有限責(zé)任公司， 陜西 西安 710075； 3.國土資源部 退化及未利用土地整治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 西安 710075； 4.陜西省土地整治工程技術(shù)研究中心， 陜西 西安 710075)

隨著社會(huì)發(fā)展，生物高分子材料由于對環(huán)境污染小，同時(shí)符合可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的要求，已逐漸替代石化高分子材料被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、化妝品及醫(yī)藥領(lǐng)域[1]。γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid， γ-PGA)是一種可由多種微生物合成的，具有生物降解性的水溶性生物高分子材料，具有良好的持水性、吸附性、生物降解性和生物相容性。1937年Ivanovics等[2]首次在一種致病的革蘭氏陽性菌——炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)的細(xì)胞莢膜中分離得到了了這種物質(zhì)。

近年來，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了利用各類新材料對土壤進(jìn)行改良和修復(fù)的研究成果。盡管各類土壤修復(fù)技術(shù)對污損土壤的修復(fù)做出了貢獻(xiàn)，但也存在如修復(fù)成本高、周期長，特別是二次污染嚴(yán)重等諸多問題[3-5]。因而，篩選高效低成本、環(huán)境友好型土壤改良劑，是土壤改良和修復(fù)研究中的重中之重。因其獨(dú)特的理化和生物學(xué)特性，近年來γ-PGA已在土壤環(huán)境改良、污損土地整治研究領(lǐng)域嶄露頭角。

1 γ-PGA的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

γ-PGA是一種陰離子高聚物，由L-谷氨酸或D-谷氨酸單體的γ-羧基與α-氨基以酰胺鍵連接而成。與普通蛋白分子相比，γ-PGA不依靠核糖體合成，因此不會(huì)被普通的蛋白酶(protease)所降解。由于γ-PGA分子側(cè)鏈上具有大量的游離羧基，使其具有強(qiáng)烈的吸水性，水溶液粘度很高[6]。不同微生物合成的γ-PGA結(jié)構(gòu)上的差異主要在于D-谷氨酸，L-谷氨酸單體的組成比例及其分子量差別，分子量一般介于100～1 000 kD，相當(dāng)于50～5 000個(gè)左右的谷氨酸單體[7-8]。近年來，人們不斷開發(fā)γ-PGA在水凝膠、保濕劑、增稠劑、成膜劑、分散劑、基因載體、藥物控釋載體、煙草、化妝品、植物種子保護(hù)、肥料增效劑及食品添加劑等方面的應(yīng)用[9]。隨著γ-PGA在新領(lǐng)域中的應(yīng)用拓展，其相關(guān)研究越來越受到人們的關(guān)注[10]。

2 γ-PGA的生物合成

2.1 γ-PGA生產(chǎn)菌

γ-PGA的合成主要通過微生物發(fā)酵法。γ-PGA生產(chǎn)菌根據(jù)發(fā)酵基質(zhì)過程中是否必需添加谷氨酸底物分為兩類：一類是需要谷氨酸作為底物來生產(chǎn)γ-PGA的菌株，即谷氨酸依賴型菌(Ⅰ型)，而另一類是不需要添加谷氨酸作為底物來生產(chǎn)γ-PGA的菌株，即非谷氨酸依賴型菌(Ⅱ型)[11]。常見的γ-PGA生產(chǎn)菌概況詳見表1。

表1 常見γ-PGA生產(chǎn)菌概況

2.2 γ-PGA生物合成機(jī)制

2.2.1 γ-PGA中碳骨架的來源 γ-PGA中的碳骨架構(gòu)成可能來源于谷氨酸(Glu)或葡萄糖(glucose)，不同發(fā)酵菌株其來源不盡相同。

Wu Q等[19]對B. subtilis NX-2發(fā)酵基質(zhì)中的葡萄糖進(jìn)行了13C標(biāo)記，同位素跟蹤分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖作為碳源主要作用于能量代謝和菌體合成，只有少部分參與了γ-PGA的合成，外源谷氨酸則是γ-PGA中碳的主要供體；而在B.subtilis(natto) MR-141[20]的發(fā)酵過程中，約6%的14C-葡萄糖參與了γ-PGA的合成，還有約35%的外源14C-Glu也被整合進(jìn)入γ-PGA的分子結(jié)構(gòu)中。由上可知，γ-PGA碳骨架來源具有菌株種屬特異性。

2.2.2 γ-PGA鏈中谷氨酸的來源 γ-PGA中的谷氨酸單體由D-Glu和L-Glu構(gòu)成。

對于谷氨酸依賴型菌(Ⅰ型)，L-Glu的來源可分為內(nèi)源-Glu和外源-Glu。一般而言，內(nèi)源-Glu由谷氨酸合酶—谷氨酰胺合成酶(GOGAT-GS)途徑合成[29]。此外，谷氨酸族的L-Pro和L-Arg均可經(jīng)異化作用生成L-Glu[30]。而絕大多數(shù)γ-PGA生產(chǎn)菌株能夠直接利用外源-Glu合成γ-PGA。Cromwick等[13]對B.licheniformisATCC 9945發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的谷氨酸進(jìn)行了13C標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)γ-PGA中的谷氨酸單體來自于外源-Glu。

γ-PGA鏈中的D-Glu單體，一般是L-Glu經(jīng)D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(D-transaminase)途徑轉(zhuǎn)化而來。Ashiuchi等[31]從B. subtilis IFO 3335中分離得谷氨酸消旋酶(glutamate racease)，為γ-PGA聚合鏈中D-Glu的來源提供了答案。

2.2.3 γ-PGA微生物合成機(jī)制 目前報(bào)道的γ-PGA最為可能的合成機(jī)理首先是ATP被谷氨酸依賴的ATP水解酶水解為ADP和Pi，然后磷酸基團(tuán)結(jié)合到小分子γ-PGA的C末端，最后L-或D-谷氨酸的氨基端與小分子γ-PGA被磷酸化了C端的發(fā)生親核攻擊，同時(shí)生成Pi并延伸γ-PGA鏈[6,31-32]。

3 γ-PGA在土壤修復(fù)和改良中的應(yīng)用

3.1 γ-PGA對旱區(qū)土壤的改良作用

長期以來，干旱成為制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。由于土壤水分缺乏所導(dǎo)致的土壤干旱和沙化，嚴(yán)重制約著我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展。土壤保水劑是近年發(fā)展迅速的一系列抗旱保水材料。γ-PGA分子中含有1 000多個(gè)超強(qiáng)的親水基團(tuán)(-COOH)，具有極佳的吸水能力，有助于維持土壤中水分，改善黏質(zhì)土壤的膨松度及空隙度，改善砂質(zhì)土壤的持水持肥能力。因此，γ-PGA在提高農(nóng)田抗旱保水能力方面具巨大的應(yīng)用潛力。例如，王傳海等[33]研究發(fā)現(xiàn)γ-PGA的最大自然吸水率可達(dá)1 108.4倍，土壤水分吸收率可達(dá)30～80倍，顯著優(yōu)于目前常見的聚丙烯酸鹽類吸水樹脂。

γ-PGA水浸液的土壤保水能力和水分緩釋效果也十分顯著，具有明顯的抗旱促苗效應(yīng)。史文娟等[34]利用土壤水分滲透模型實(shí)驗(yàn)，在土壤中施加4%的γ-PGA后水分累積入滲量、入滲率和濕潤鋒分別減小了57.95%，53.89%和59.58%，土壤飽和含水率明顯提高。同時(shí)γ-PGA還能改變土壤剖面中水分分布形態(tài)，使水分更多地集中在作物的根層區(qū)域，從而有利于提高作物的水分利用效率。張新民等[35]在干土中直接施用γ-PGA水浸液，相比澆水試驗(yàn)?zāi)軌蚩s短小麥出苗期，增加苗高，加深根系的最大深度。隨著γ-PGA水浸液用量的增加，對小麥生長的促進(jìn)效果也越明顯。上述研究成果表明了γ-PGA具有較好的土壤保水和吸水性能，能夠提高作物對水分的有效利用率，為其在農(nóng)田抗旱保水、旱區(qū)土壤改良領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可能。

同時(shí)，利用γ-PGA生產(chǎn)菌直接對土壤進(jìn)行保水的研究已見報(bào)道。河海大學(xué)[36]通過一株能夠合成谷氨酸的與一株能夠合成γ-PGA的功能微生物復(fù)合菌株，發(fā)明了一種能夠適應(yīng)干旱貧瘠土壤環(huán)境的農(nóng)田土壤微生物保水制劑。該制劑用于粉砂質(zhì)土壤中可以顯著提高油菜株高和產(chǎn)量，增加土壤導(dǎo)水率及飽和含水量。

3.2 γ-PGA對鹽堿土壤的改良

土壤鹽堿化是一個(gè)世界性難題。全世界鹽堿土面積已達(dá)1.0×109hm2，且每年以(1.0×106～1.5×106hm2的速度增長。自20世紀(jì)60年代起，中國傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中由于不合理灌概，土壤中大量鹽分隨水分蒸發(fā)向上運(yùn)動(dòng)而聚集在土表，造成土壤板結(jié)和鹽堿化等環(huán)境問題，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量下降，目前中國已有近1/5耕地發(fā)生鹽堿化。

世界各地相繼開展了多種農(nóng)業(yè)和化學(xué)方法對鹽堿地進(jìn)行改良。農(nóng)業(yè)改良只能局部減輕土壤鹽堿化程度，對大面積鹽堿地的改良，仍存在困難；化學(xué)改良一般用于重度鹽堿地的修復(fù)，見效快，卻因易引進(jìn)新離子而造成土壤二次污染。因此，尋找一種高效、可降解、無污染的新型鹽堿土壤改良劑成為目前亟待解決的問題。

侯亞玲等[37]研究了枯草芽孢桿菌對鹽堿土壤水分運(yùn)動(dòng)及土壤水穩(wěn)定團(tuán)聚體的影響，表明枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的γ-PGA可以顯著降低土壤入滲能力，增強(qiáng)土壤持水能力，改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，進(jìn)而達(dá)到對鹽堿土壤進(jìn)行改良的效果。西南大學(xué)[38]研究了γ-PGA與耐鹽植物對鹽漬土壤聯(lián)合修復(fù)的效果，與單一γ-PGA及耐鹽植物去除鹽離子效果相比，聯(lián)合修復(fù)的鹽離子去除率顯著提高，實(shí)驗(yàn)獲得修復(fù)Ca2+，Mg2+，NO3-型次生鹽漬化土壤的最佳組合為1 000 mg/L γ-PGA和景天三七(J3)，總鹽分的最終去除率可達(dá)到74.72%。Chen Lihua等[39]利用γ-PGA對沿海地區(qū)的鹽漬土壤進(jìn)行改良，與對照組相比，γ-PGA處理的土壤含鹽量降低了39.93%，總氮流失率降低了65.37%，水土抗侵蝕系數(shù)顯著提高，土壤團(tuán)聚體得以改善，結(jié)果表明γ-PGA可以有效維持海水浸侵土壤的總氮含量并對沿海鹽漬土壤進(jìn)行改良。

3.3 γ-PGA對重金屬污染土壤的修復(fù)

土壤重金屬污染的修復(fù)研究己成為國內(nèi)外土壤環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題之一。近年來，中國某些地區(qū)土壤重金屬污染程度逐步加劇，被重金屬污染的耕地面積達(dá)1.33×106hm2，尤其在一些有色金屬礦區(qū)。位于城市和工業(yè)污水集中排放區(qū)的農(nóng)田重金屬含量嚴(yán)重超標(biāo)，土壤污染正逐步動(dòng)搖著我國糧食安全的根基，對全球生態(tài)環(huán)境構(gòu)成極大威脅。目前，對重金屬污染土壤的修復(fù)主要有：物理修復(fù)、生物修復(fù)、工程措施修復(fù)、化學(xué)鈍化修復(fù)等技術(shù)。γ-PGA具有超強(qiáng)的吸附性能，可高效、快速的對Pb，Cr，Cd，Al，As等土壤重金屬進(jìn)行螯合，使其不被作物所吸收，從而達(dá)到生產(chǎn)安全農(nóng)產(chǎn)品的目的。

Zonghan Yang等[40]在重金屬污染的土壤中應(yīng)用γ-PGA，使用200 mM的γ-PGA在pH=6，液固比為10∶1的條件下浸提土壤30 min后，對土壤中Cr，Ni，Cu，Zn的去除率分別可達(dá)30%，27%，45%和43%。Zhu Jun等[41]將使用γ-PGA活化后的磷礦粉應(yīng)用于被重金屬污染的農(nóng)田，隨著γ-PGA活化濃度由0～20 g/L梯度增加，活化后的Baokang磷礦粉和Nanzhang磷礦粉對土壤殘?jiān)鼞B(tài)鉛的去除效果分別增加了200%和150%。在鉛污染土壤中使用γ-PGA活化的兩種磷礦粉后，小白菜產(chǎn)量均顯著增加，同時(shí)小白菜根、葉中的鉛含量也明顯減少。因此，使用γ-PGA活化的磷礦粉一定程度上可以起到土壤鉛的固化作用，減少鉛在土壤中的移動(dòng)性，同時(shí)能夠阻止植物對鉛的吸收。由此能夠推斷，γ-PGA在修復(fù)重金屬污染土壤的過程中具有重要作用。

3.4 γ-PGA對土壤肥力的改良

隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展和人口的迅猛增長，耕地肥力和耕地質(zhì)量問題越來越受到人們的關(guān)注。目前，中國人口和非農(nóng)占地面積的逐年上升，人均耕地逐年減少，對于中國這樣一個(gè)人口大國，這是極其嚴(yán)重的問題。因此，如何保持和提高土壤肥力，提高耕地質(zhì)量，提高單位面積生產(chǎn)能力，應(yīng)引起全國人民的高度重視。

徐宗奇等[42]利用盆栽實(shí)驗(yàn)研究了γ-PGA對小青菜產(chǎn)量及土壤中銨態(tài)氮的影響。γ-PGA在肥料缺乏時(shí)對小青菜的增產(chǎn)效果尤為明顯。同時(shí)γ-PGA處理能顯著降低小青菜中硝酸鹽的含量，增加維生素C的含量，提高小青菜的品質(zhì)。γ-PGA還有助于土壤中銨態(tài)氮的積累，提高土壤肥力。而蔡志堅(jiān)[43]對γ-PGA活化磷礦粉進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)γ-PGA能促進(jìn)磷礦粉的釋磷作用，具有活化磷礦粉的效果，并且隨著γ-PGA的活化濃度由0～20.0 g/L不斷升高，磷礦粉中水溶性磷的釋放量成逐漸增加的趨勢。與此同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)施用γ-PGA活化磷礦粉比單施磷礦粉對小白菜產(chǎn)量具有更大的增效，最大增幅可達(dá)23.6%。Zhang Lei等[44]將13C-15N標(biāo)記的γ-PGA施用與小白菜生長的土壤中，γ-PGA不僅可以提高小白菜根的養(yǎng)分吸收能力，提高小白菜產(chǎn)量，同時(shí)可以作為N源為植物的生長提供營養(yǎng)，具有植物環(huán)保氮肥研究前景。

3.5 γ-PGA對土壤酸堿性的平衡

γ-PGA具有極佳的緩沖能力，可有效平衡土壤酸堿值，緩解因長期使用化學(xué)肥料引起的土壤酸化及土壤板結(jié)[45]。

以膠東半島為例，眾多蘋果果園存在土壤酸化的情況。在每1 hm2施用γ-PGA發(fā)酵液約15 L后，過段時(shí)間觀察，γ-PGA可明顯提高酸性土壤的pH值1～2個(gè)單位，改善因酸化造成的果樹苦痘等病害，同時(shí)改善果實(shí)的品質(zhì)。另外，γ-PGA對于使用過量化學(xué)肥料造成的次生酸化也有很好的調(diào)節(jié)作用[46]。

4 γ-PGA對土壤環(huán)境的影響

在利用γ-PGA對土壤進(jìn)行改良或修復(fù)時(shí)，我們還應(yīng)充分考慮到γ-PGA的土壤環(huán)境的影響作用。在γ-PGA的土壤應(yīng)用研究中，已有學(xué)者對其進(jìn)行了報(bào)道。

Zhang Lei等[47]在砂質(zhì)黏壤土中應(yīng)用γ-PGA，研究了其土壤碳氮累計(jì)損失量及CO2排放量的變化。結(jié)果表明，當(dāng)γ-PGA濃度為0.1 g/kg時(shí)，土壤無機(jī)銨及硝酸鹽累計(jì)損失減少了29.31%和52.42%；濃度為0.2～0.8 g/kg時(shí)，可溶性氮累計(jì)損失減少了7.16%～40.10%，可溶性有機(jī)碳幾乎沒有變化，而CO2排放量卻顯著增加了26.87%～180.70%。土壤總氮及有機(jī)碳含量隨著γ-PGA濃度的變化而改變。Xu Zongqi等[48]使用γ-PGA作為氮肥增效劑時(shí)，發(fā)現(xiàn)土壤中微生物數(shù)量及微生物多樣性都顯著增加。這與Chen Lihua等[39]的研究成果相一致。

5 研究展望

作為環(huán)境友好型生物材料，γ-PGA在土壤修復(fù)和改良領(lǐng)域巨大的開發(fā)潛力是毋庸置疑的。為增強(qiáng)γ-PGA在土壤整治領(lǐng)域的應(yīng)用能力，在今后的研究中應(yīng)重點(diǎn)開展以下4個(gè)方面的工作：

(1) 選育優(yōu)良菌種，提高γ-PGA發(fā)酵產(chǎn)率；加大科研力度，開發(fā)γ-PGA工業(yè)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝，讓這種環(huán)境友好型生物材料真正服務(wù)于社會(huì)。

(2) 直接利用γ-PGA菌種發(fā)酵液進(jìn)行土壤修復(fù)和改良實(shí)驗(yàn)，探索實(shí)驗(yàn)成果轉(zhuǎn)化技術(shù)，達(dá)到應(yīng)用過程簡化，提高資源利用率。

(3) 選育適應(yīng)各類型土壤的γ-PGA高活性菌株，通過基質(zhì)復(fù)配或菌種復(fù)配等手段，制備得到直接施用于土壤的生物菌種型土壤修復(fù)劑或改良劑。

(4) 應(yīng)加強(qiáng)γ-PGA與不同類型土壤物質(zhì)之間相互作用的機(jī)理研究，從而擴(kuò)大其在土壤整治領(lǐng)域的應(yīng)用范圍和應(yīng)用效果，為其應(yīng)用推廣奠定基礎(chǔ)。

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