斑點叉尾“腹水癥”病原的分離鑒定及體外芽孢桿菌拮抗試驗

王亞軍，魏文娟，潘厚軍，顏 曦，王 芳，石存斌

(中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部漁用藥物創(chuàng)制重點實驗室，廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室，廣州 510380)

1 實驗材料與方法

1.1 實驗魚

1.2 試劑與菌株材料

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、水解酪蛋白 (MH) 瓊脂、LB培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司；5%羊血瓊脂培養(yǎng)基購自廣州市迪景微生物科技有限公司；革蘭染色試劑盒購自廈門邁威生物科技有限公司；細菌鑒定試劑條及相關(guān)配套試劑均購自法國梅里埃公司(BioMereux)；細菌DNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR擴增引物由生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成；藥敏紙片為英國Oxid產(chǎn)品；基因測序由廣州艾基生物有限公司進行。

地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)Bl160913株、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Bs160913株、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)Bp160913株和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)Ba160912株4株芽孢桿菌均由本實驗室分離、鑒定和保存。

1.3 病原菌的分離

將發(fā)病魚按常規(guī)方法剖檢，無菌條件下從病魚的肝臟、脾臟、腎臟等病灶組織取樣，分別在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和兔血瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑選大小形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落再純化，分離得到優(yōu)勢菌1株，轉(zhuǎn)接普通營養(yǎng)瓊脂平板，4 ℃保存?zhèn)溆肹9]。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 革蘭氏染色鑒定

無菌條件下在潔凈的載玻片上滴少許生理鹽水，用接菌環(huán)將分離純化后的單菌落均勻地涂布到盛有生理鹽水的載玻片上，待其自然風干后，用結(jié)晶紫染液對其初染1 min，再用碘液媒染 1 min，后用脫色液脫色20～30 s，最后用番紅染色進行復染1 min，鏡檢。

1.4.2 生化鑒定

按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]，根據(jù)革蘭氏染色結(jié)果選用BioMereux ID 32 GN(革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條及配套試劑)，檢測優(yōu)勢菌株的生化特性[11]。

1.4.3 分子生物學鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

根據(jù)DNA提取試劑盒說明提取優(yōu)勢菌株DNA。利用Primer 5.0 軟件設計16S rDNA基因擴增所用引物和gyrB基因擴增引物，16S rDNA上下游引物序列分別為：27F：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′，1492R ：5′GGTTACCTTGTTACGACTT 3′；gyrB上下游引物序列分別為：F:5’-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′，R:5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′ 。PCR反應體系均為：上下游引物各1.0 μL，mix 11.0 μl，ddH2O 10.0 μL，DNA模板 2.0 μL。擴增16S rDNA PCR反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min 。擴增gyrB PCR反應程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

PCR反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、送廣州艾基生物技術(shù)公司測序，將所得到的gyrB DNA序列運用NCBI的BLAST程序在Genbank進行同源序列比對并利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹[12-13]。

1.5 回歸感染

1.6 藥敏試驗

將純化得到的細菌接種于LB液體培養(yǎng)基，28 ℃震蕩(200 r/min)培養(yǎng)4 h，用無菌生理鹽水稀釋菌液，達到0.5個麥氏濁度，再按1∶100稀釋菌液至含菌量約為1.5 × 106CFU /mL?；靹蛉?00 μL至MH培養(yǎng)基平板中涂布均勻，其上放置藥敏紙片， 28 ℃培養(yǎng)20 h后測量不同藥物的抑菌圈直徑(mm)，參照美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI) 文件標準判斷致病菌株對藥物的敏感程度[14 -16]。

1.7 芽孢桿菌的拮抗作用

分別將短小芽孢桿菌Bp160913株、枯草芽孢桿菌Bs160913株、地衣芽孢桿菌Bl160913株及解淀粉芽孢桿菌Ba160912株接種到裝有5.0 mL LB液體培養(yǎng)基試管中，37 ℃， 160 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，用無菌生理鹽水稀釋各菌液，均達到0.5麥氏濁度。將分離純化的分離菌單菌落接種到裝有5.0 mL營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基試管中，置37 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)4 h后，用無菌生理鹽水稀釋菌液，達到0.5麥氏濁度，取出10 μL稀釋100倍均勻涂布MH 平板，靜待一段時間后，其上放置牛津杯，輕輕加壓使其與培養(yǎng)基完全緊密結(jié)合，防止漏液，在牛津杯中加入150 μL不同種的芽孢桿菌培養(yǎng)液，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈的直徑。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離與革蘭氏染色

圖1 菌株cw-1革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 Gram staining results of strain cw-1

2.2 生化鑒定

菌株cw-1生理生化鑒定特性見表1， D-葡萄糖、脯氨酸、D-甘露醇等反應呈陽性，而D-蜜二糖、肌醇和L-鼠李糖等反應呈陰性，根據(jù)鑒定百分率(%id)為99.9，T(期望值)為0.88，以及無不符試驗，初步鑒定分離菌株為溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)。

表1 分離菌株cw-1的生化特性Tab.1 Biochemical characteristics of cw-1 strains isolated from Ictalurus punctatus

注： “+”—陽性；“-”—陰性；d.75%陽性。

圖2 cw-1菌株16S rDNA基因PCR擴增電泳圖 Fig.2 The PCR products for 16S rDNA gene of cw-1 strain

2.3 分子生物學鑒定

PCR擴增cw-1的16S rDNA基因(圖2)，經(jīng)測序和Genbank比對，比對結(jié)果表明分離菌株cw-1屬于氣單胞菌類，相似度達到99%。對其gyrB基因進行PCR擴增，結(jié)果顯示擴增的基因長度約為1 040 bp(圖3)。根據(jù)gyrB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)菌株cw-1與溫和氣單胞菌的親緣關(guān)系最近，自然聚類為一支(圖4)，說明該菌株確為溫和氣單胞菌。

圖3 cw-1 gyrB基因PCR擴增電泳圖Fig.3 The PCR Products for gyrB Gene of cw-1 strain

圖4 cw-1菌株 gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of gyrB gene of cw-1 strain線長代表遺傳距離

2.4 回歸感染

表2 回歸感染結(jié)果Tab.2 Results of the recurrent infection

2.5 藥敏試驗結(jié)果

通過紙片擴展法測試了菌株cw-1對10種常見藥物敏感性，具體結(jié)果見表3。菌株cw-1對恩諾沙星、氟苯尼考、氧氟沙星等6種藥物敏感，對磺胺復合藥物和鏈霉素中度敏感，而對四環(huán)素、強力霉素耐藥。

表3 藥敏實驗結(jié)果Tab.3 Results of the drug sensitivity test

注： S—敏感 (直徑>17 mm)； I—中度敏感 (13 mm≤直徑≤17 mm)； R—不敏感(耐藥)(直徑<13 mm)

2.6 芽孢桿菌的拮抗結(jié)果

3 討論

溫和氣單胞菌屬弧菌科，革蘭氏陰性菌，是一種條件致病菌，分布廣泛，其主要致病因子包含腸毒素、溶血素等，感染后發(fā)病率高、發(fā)病迅速及死亡快[17]，常引起水生動物大規(guī)模發(fā)病，是危害我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌之一[18]。本實驗從患“腹水癥”的斑點叉尾上分離出的菌株為溫和氣單胞菌，此結(jié)果與韋昌用等[19]報道的腹水病病原一致，雖與鐘妮娜等[20]報道的腹水癥病原不同，與蘇應兵等[2]報道的暴發(fā)性敗血癥病原也不完全一致，但發(fā)病斑點叉尾所表現(xiàn)出的“腹水”、眼球突出、內(nèi)臟腫大等癥狀相似。據(jù)以往的報道，高溫季節(jié)溫和氣單胞菌與嗜水氣單胞菌常單獨或者混合感染[21-22]，引起的癥狀也相似，這可能是本實驗與以上報道的“腹水癥”病原存在不一致情況的原因。

表4 芽孢桿菌的拮抗作用Tab.4 Antagonism of Bacillus mm

注：牛津杯直徑7 mm

16S rDNA序列分析已成為細菌種屬鑒定和分類的標準方法[23]，但這種細菌分析方法存在一定的局限性，只能在細菌屬的水平上區(qū)分。gyrB基因是一種可以編碼蛋白的基因，此基因存在于大多數(shù)細菌中，在細菌的系統(tǒng)發(fā)育學，特別是在近緣種和菌株的區(qū)分及鑒定方面受到高度關(guān)注[24,25]，Soler等[26]研究發(fā)現(xiàn)gyrB基因?qū)ο嘟姆N具有很高的分辨率，本實驗先采用16S rDNA基因進行分離菌株屬的鑒定，確定發(fā)病斑點叉尾其病原為氣單胞菌類，其后用gyrB基因擴增鑒定菌株，進一步確定菌株為溫和氣單胞菌。

根據(jù)藥敏實驗結(jié)果，菌株對強力霉素和四環(huán)素產(chǎn)生耐藥性，而對此實驗中其他8種常用藥物均有敏感性，說明此養(yǎng)殖場尚未濫用藥物，在養(yǎng)殖過程中若發(fā)生此類細菌引起的疾病，可根據(jù)實際情況合理使用氟苯尼考等藥物治療，但要注意避免長期使用同一種藥物，以防病原菌產(chǎn)生耐藥性而導致防治無效[27]。由于抗生素濫用造成的弊端，近幾年生物防治和生態(tài)防治日漸興起[28]，據(jù)報道，芽孢桿菌能分泌一種具有抑菌活性的抑菌物質(zhì)[29]，解淀粉芽孢桿菌對嗜水氣單胞菌具有明顯的拮抗作用，將其作為益生菌添加劑添加到飼料中用于動物生產(chǎn)，不僅有較好防病效果還可提高動物生產(chǎn)性能[30-32]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種芽孢桿菌對溫和氣單胞菌均有拮抗作用，但拮抗作用大小不同，地衣芽孢桿菌及解淀粉芽孢桿菌作用較為顯著，下一步應定量分析芽孢桿菌拮抗溫和氣單胞菌的數(shù)量的關(guān)系，及其抗菌活性物質(zhì)及抗菌機理。

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