KK-42對日本沼蝦表皮蛋白基因MnCP-1表達(dá)的上調(diào)效應(yīng)

苗澤龍，黃亞龍，呂艷杰，寧黔冀

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007)

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)隸屬于軟甲亞綱(Subclass Malacostraca)十足目(Order Decapoda)長臂蝦科(Palaemonidae)沼蝦屬(Macrobrachium)，是我國十分重要的淡水食用蝦，其堅硬的表皮可以預(yù)防外界有害機(jī)體的物質(zhì)進(jìn)入，防止機(jī)體內(nèi)部水和離子的丟失，表皮中的有機(jī)物主要是幾丁質(zhì)和表皮蛋白(cuticle proteins，CPs)[1]，大多數(shù)的CPs都能結(jié)合幾丁質(zhì)構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)其氨基酸序列的不同將CPs劃分為不同的家族，其中CPR (Cuticular Protein with Rebers Riddiford Consensus)家族是CPs中最大的家族，包含有保守的RR基序(Rebers-Riddiford consensus sequence)[2,3]，即Gx8Gx6YxAxExGYx7Px2P(其中x代表的是任意一種氨基酸殘基)，該基序現(xiàn)在被公認(rèn)為是結(jié)合幾丁質(zhì)的保守域，能夠促進(jìn)幾丁質(zhì)纖維和蛋白質(zhì)基質(zhì)間的相互作用[4,5]。在昆蟲中對CPs的研究較為廣泛，根據(jù)RR序列的變異程度進(jìn)一步劃分為三個亞族：RR-1，RR-2和RR-3[6]。而對甲殼動物CPs的研究報道相對較少，目前，通常以是否含有幾丁質(zhì)結(jié)合-4(chitin_bind_4，又叫pfam00379)結(jié)構(gòu)域作為判斷CPs的主要依據(jù)[4]，該結(jié)構(gòu)域其實是RR-1和RR-2亞族CPs的復(fù)合物[2]。

理論上，CPs的表達(dá)應(yīng)該與甲殼動物的蛻皮周期有關(guān)。采用直接分離純化方法，先后從日本對蝦(Penaeusjaponicus)尾扇[7,8]、藍(lán)蟹(Callinectessapidus)背部表皮[9,10]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)尾扇[11-14]等發(fā)現(xiàn)了數(shù)目不等的CPs，根據(jù)氨基酸序列推定編碼蛋白的核苷酸序列，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平上研究相關(guān)基因的表達(dá)在蛻皮周期中的變化，分析CPs在新舊表皮更替中的作用。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，通過足夠的已知序列信息進(jìn)行基因功能的預(yù)測也已經(jīng)成為一種有效的研究手段，比如Kuballa等[15]利用轉(zhuǎn)錄組測序，比較遠(yuǎn)海梭子蟹(Portunuspelagicus)在蛻皮周期不同階段差異性表達(dá)基因的模式，探討其可能的功能。

實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，咪唑類物質(zhì)KK-42可以顯著縮短日本沼蝦的蛻皮周期[16]， 推測KK-42的作用機(jī)理可能與CPs表達(dá)的改變有關(guān)。由于CPs在不同物種間的相似性較低，有關(guān)日本沼蝦CPs基因及其功能的研究目前尚未見報道。因此，本試驗結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序和RACE技術(shù)，從頭胸甲中克隆了一個編碼日本沼蝦CPs的全長cDNA序列，命名為MnCP-1，采用Real-time PCR分析了不同蛻皮時期MnCP-1在頭胸甲中的表達(dá)，以及KK-42處理之后不同時間點(diǎn)MnCP-1的表達(dá)變化，為闡明KK-42的作用機(jī)理積累資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和KK-42處理

日本沼蝦于2017年5-8月捕撈于河南衛(wèi)輝順城關(guān)公園，選取健康幼蝦(體長3.0～4.0 cm)200尾隨機(jī)分為對照組和實驗組飼養(yǎng)于水族箱中，水溫(22±1)℃，每天早上晚上各投喂一次，一周后用于實驗。處理組使用濃度為1.95 ×10-4mol/L的KK-42浸泡1 min后迅速放入原水族箱內(nèi)，按原方式喂養(yǎng)，同時以不含KK-42的溶液作為對照組做相同處理[17]。

1.2 RNA的提取

分別選取C期(蛻皮間期)、D0-2期(蛻皮前期早期)、D3-4期(蛻皮前期晚期)和A期(蛻皮后期)各4～5只幼蝦，快速分離頭胸甲組織，KK-42浸泡后的0、3、6、12、24和48 h的實驗組和對照組分別取C期和D0-2期的頭胸甲組織，利用Mini BEST Universal RNA Extraction Kit(TAKARA)試劑盒，按照說明書的操作步驟提取上述表皮組織的RNA。實驗重復(fù)三次。蛻皮周期的鑒定依據(jù)Cesar等[18]的方法。

1.3 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA

利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒5X All-In-One RT Master Mix(abm)，按照說明書的反轉(zhuǎn)錄條件將提取出的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板。

1.4 MnCP-1 cDNA全長獲得

利用軟件Prime primer 5設(shè)計RACE外引物GSP-5′-outer和GSP-3′-outer以及RACE內(nèi)引物GSP-5′-inner和GSP-3′-inner(表1)，同時分別制備5′ RACE cDNA和3′ RACE cDNA。按照SMARTer RACE 5′/3′Kit(Clontech)說明書的操作步驟送生物工程股份有限公司測序拼接后得到MnCP-1 cDNA全長序列。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用Conserved Domain (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)確定MnCP-1的幾丁質(zhì)結(jié)合保守域，利用Open Reading Frame (ORF)Finder (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf.html)分析預(yù)測開放閱讀框，并推導(dǎo)其編碼的氨基酸序列。使用 DNAMAN 軟件對這些基因進(jìn)行多序列比對分析。相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)應(yīng)用在線工具ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)計算，使用MEGA6.06軟件，采用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建MnCP-1系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 MnCP-1的表達(dá)分析

根據(jù)引物設(shè)計原則，利用軟件Prime primer 5設(shè)計上、下游引物(表1)。按照AceQTM qPCR SYBR?Green Master Mix (Vazyme)試劑盒說明書步驟操作，β-actin為內(nèi)參基因，實驗均設(shè)3個重復(fù)，采用比較Ct值(2-ΔΔCt法)計算相對表達(dá)量，使用SPSS13.0進(jìn)行顯著性分析，P<0.01表示差異極顯著。

表1 實時熒光定量PCR和RACE相關(guān)引物Tab.1 Primer sequences used for Real-time PCR and RACE

2 結(jié)果

2.1 MnCP-1的序列分析

MnCP-1 GenBank登錄號為 KY065119，基因的cDNA序列全長為604 bp，包含69 bp的5′-非編碼區(qū)(Untranslated region，UTR)和166 bp的3′-UTR以及369 bp的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼122個氨基酸，在其3′-UTR包含多聚腺苷酸加尾信號AATAAA。幾丁質(zhì)結(jié)合-4結(jié)構(gòu)域位于126～281 bp(圖1)，預(yù)測的MnCP-1蛋白相對分子質(zhì)量為13.394 kD，分子式為C598H909N161O186S2，理論等電點(diǎn)為4.41。MnCP-1與普通黃道蟹(Cancerpagurus，P81576.1)有61%的相似性(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，MnCP-1和地中海實蠅(Ceratitiscapitata)親緣關(guān)系最近，聚為一支(圖3)。

圖1 MnCP-1全長cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Full length sequence of MnCP-1 cDNA and deduced amino acid sequence灰色表示chitin_bind_4結(jié)構(gòu)域，細(xì)線方框加粗字母表示RR基序保守位點(diǎn)，*表示終止密碼子

圖2 MnCP-1的保守區(qū)域氨基酸序列與其它物種的序列比對Fig.2 The alignment of amino acid sequences of putative catalytic region of MnCP-1 with those from other species黑色代表相同水平為100%，灰色代表相同水平≥50%

圖3 使用MEGA 6.06采用鄰接法構(gòu)建MnCP-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of selected MnCP-1 constructed using the neighbor-joining method in MEGA 6.06

蚤狀溞(Daphnia pulex)EFX73274.1；大型溞(D.magna)KZR99743.1；黑脈金斑蝶(Danaus plexippus plexippus)OWR47245.1；棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)XP 021200909.1；長角長蟲兆(Orchesella cincta)ODM98266.1；地中海實蠅(Ceratitiscapitata)XP 020712733.1；藍(lán)蟹(Callinectessapidus)AAV28476.1；家蠶(Bombyxmori)NP 001166710.1；白符跳(Folsomia candida)XP 021957998.1；日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)BAA90876.1；埃及伊蚊(Aedes aegypti)XP 001659105.1；柑橘鳳蝶(Papilio xuthus)KPI97902.1；金鳳蝶(P.machaon)KPJ11380.1；普通黃道蟹(Cancer pagurus)P81576.1；美洲螯龍蝦(Homarus americanus)P81386.1；果蠅(Drosophila mojavensis)XP 002007519.2；日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)AQT18916.1 用黑三角標(biāo)定

2.2 MnCP-1的表達(dá)與蛻皮周期的關(guān)系

在蛻皮周期的不同階段，頭胸甲中MnCP-1的表達(dá)量變化顯著，D3-4和A 期的表達(dá)量較高，分別是C期的27和183倍(圖4)。

2.3 MnCP-1在KK-42處理后的表達(dá)變化

KK-42對頭胸甲MnCP-1的表達(dá)有顯著的上調(diào)效應(yīng)，尤其是C期和D0-2期。與對照組在各個時間點(diǎn)相對穩(wěn)定的表達(dá)不同，C期的處理組在6、12、24和48 h分別較對照組提高6、4、34和24倍以上(圖5)。D0-2期的表達(dá)量在3 h急劇升高達(dá)到峰值，6 、24和48 h分別比對照增高了10、26和3倍以上(圖6)。

圖4 頭胸甲內(nèi)MnCP-1在蛻皮周期不同階段的表達(dá)變化Fig.4 The expression variation of MnCP-1 in carapace at different molt stagesC.蛻皮間期；D0-2.蛻皮前期早期；D3-4.蛻皮前期晚期；A.蛻皮后期；n=5/蛻皮階段；“**”表示與C期相比有極顯著差異(P<0.01)

圖5 KK-42對C期頭胸甲MnCP-1 mRNA表達(dá)的影響Fig.5 The effect of KK-42 on the expression of MnCP-1 in carapace at stage C n=5/組/時間點(diǎn)；“**”表示與相應(yīng)對照組相比有極差異顯著(P<0.01)，下同

3 討論

CPs是構(gòu)成甲殼動物表皮的基本成分，它是由上皮細(xì)胞按照一定的周期和步驟表達(dá)和合成的重要的結(jié)構(gòu)性蛋白。本研究首次從日本沼蝦的頭胸甲中克隆出了含有幾丁質(zhì)結(jié)合-4結(jié)構(gòu)域的MnCP-1 cDNA全長(圖1)，經(jīng)多序列比對，MnCP-1與甲殼動物的多種CPs的相似性在40 %～61 %之間(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建表明，甲殼動物與昆蟲的CPs有著共同的祖先，隨著時間的推移，動物進(jìn)化分化出了不同的CPs，其中MnCP-1與地中海實蠅的親緣關(guān)系最近(圖3)。

圖6 KK-42對D0-2期日本沼蝦頭胸甲MnCP-1 mRNA表達(dá)的影響Fig.6 The effect of KK-42 on the expression of MnCP-1 in carapace at stage D0-2

研究表明，在蛻皮前期的晚期(D3-4期)新上表皮層下出現(xiàn)了越來越厚的新外表皮，在蛻皮后不久(A期)，上皮細(xì)胞層會繼續(xù)在新外表皮下合成新的內(nèi)表皮[19]。甲殼動物中，多數(shù)CPs的表達(dá)與蛻皮周期密切相關(guān)?？耸显r尾扇中的一種基質(zhì)蛋白(被命名為Casp2)[13]和藍(lán)蟹關(guān)節(jié)膜中的兩種蛋白(被命名為CsAMP8.1和CsAMP13.4)[9,10]在蛻皮周期的D3-4期和A期表達(dá)最高，被認(rèn)為參與外表皮與內(nèi)表皮的形成。本研究結(jié)果與之類似，MnCP-1在D3-4和A期有高表達(dá)(圖4)，推測MnCP-1既參與了新外表皮的形成，又參與了蛻皮后新內(nèi)表皮的形成。當(dāng)然，在今后的研究中蛋白水平的驗證是必要的。

合成和分泌CPs的表皮上皮細(xì)胞是蛻皮激素作用的靶細(xì)胞之一，實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，KK-42能誘導(dǎo)日本沼蝦蛻皮激素濃度峰值提前出現(xiàn)[20]，與處理組MnCP-1在C和D0-2期的高表達(dá)結(jié)果一致(圖5，6)，提示KK-42可能通過提高蛻皮激素的濃度間接調(diào)節(jié)MnCP-1的表達(dá)，具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步探究。MnCP-1在C和D0-2期轉(zhuǎn)錄水平的升高可能加快了日本沼蝦新表皮的形成，促進(jìn)了蛻皮進(jìn)程，從而縮短蛻皮周期。

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