大麥青稞小孢子高頻再生體系的建立及其在遺傳育種上的應(yīng)用

劉成洪，郭桂梅，何 婷，陸瑞菊*，黃劍華*

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海201106；2.上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201106）

大麥?zhǔn)俏覈?guó)啤酒工業(yè)不可替代的主體原料，也是畜牧養(yǎng)殖業(yè)的優(yōu)質(zhì)能量飼料，還是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的食品加工原料，對(duì)促進(jìn)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和滿足人民群眾健康生活需求發(fā)揮重要作用。青稞為食用裸大麥，是青藏高原藏族人民等賴以生存和繁衍的主要食物來源，對(duì)西部發(fā)展和邊疆穩(wěn)定也具有重要意義[1]。我國(guó)大麥種植區(qū)域遼闊，生產(chǎn)用途多樣化，市場(chǎng)需求巨大，因此需要選育更多更好的大麥新品種來滿足國(guó)內(nèi)生產(chǎn)需要[2]。

要加速新品種的選育，必須加大育種技術(shù)研發(fā)力度。小孢子培養(yǎng)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)高效的單倍體育種手段，該技術(shù)已在油菜、煙草和大麥等作物育種中實(shí)現(xiàn)[3]，但這一技術(shù)的真正推廣應(yīng)用在很大程度上受到技術(shù)體系的成熟度和育種材料的基因型限制。為了解決大麥青稞育種中的這一瓶頸問題，筆者所在植物細(xì)胞工程科研團(tuán)隊(duì)經(jīng)過多年技術(shù)攻關(guān)，在大麥中建立了小孢子高頻再生的成熟體系，并在來自全國(guó)各地大量育種材料中成功取得小孢子培養(yǎng)再生綠苗，進(jìn)一步與各地育種團(tuán)隊(duì)合作育成了一批大麥和青稞優(yōu)良新品系和品種，在此基礎(chǔ)上還拓展了系列大麥遺傳改良新方法。

1 大麥小孢子高頻再生體系的建立

針對(duì)大麥生產(chǎn)上的主栽品種或育種材料建立小孢子高頻再生體系，是將小孢子培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于大麥育種生產(chǎn)實(shí)踐的一個(gè)前提條件。只有通過小孢子離體培養(yǎng)再生，獲得足夠多的加倍單倍體（double haploid，DH）植株，進(jìn)一步產(chǎn)生永久純合穩(wěn)定的DH株系，才能用于目標(biāo)性狀篩選。筆者通過對(duì)供體植株生長(zhǎng)、離體穗預(yù)處理、小孢子游離提取液、小花共培養(yǎng)、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)分化時(shí)間、分化培養(yǎng)基、壯苗生根、倍性鑒定、加倍處理、煉苗移栽等各個(gè)步驟進(jìn)行優(yōu)化，針對(duì)我國(guó)大麥主栽品種或育種材料建立了小孢子高頻再生體系（表1）。

利用上述建立的大麥小孢子高頻再生體系，從我國(guó)大麥栽培的不同生態(tài)區(qū)，選取代表性主栽品種，于2017年開展了游離小孢子培養(yǎng)。針對(duì)北方春大麥區(qū)，選取了黑龍江省農(nóng)墾總局紅興隆農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的墾啤麥7號(hào)和甘肅省農(nóng)科院啤酒原料研究所選育的甘啤6號(hào)；針對(duì)黃、淮以南秋播大麥區(qū)，選取了江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所與中科院遺傳所合作選育的蘇啤3號(hào)，同時(shí)選取了上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院與浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院合作選育的花30作為對(duì)照。結(jié)果表明，在4份大麥主栽品種中，花30的小孢子再生綠苗頻率最高（表2），達(dá)到平均每皿378.7株（小孢子為1×105個(gè)/皿），較前期報(bào)道的另一大麥主栽品種花22的小孢子綠苗再生頻率[253株/（1×105個(gè)小孢子）]有了更進(jìn)一步提高[4]，超過了國(guó)外花培反應(yīng)高的模式品種Igri的再生頻率，其最高花培再生頻率為1 009.8株/（100個(gè)花藥），綠苗數(shù)占總再生苗的87.6%[5]，按每個(gè)花藥平均獲得3 000個(gè)游離小孢子折算[6]，其再生頻率為295株/（1×105個(gè)小孢子）。其次為甘啤6號(hào)，小孢子綠苗再生頻率為216.3株/（1×105個(gè)小孢子），有著較高的綠苗比例（表2）。由此可以看出，4份材料的小孢子再生綠苗單皿均可達(dá)到百株以上。此外仍有部分白苗，白苗比例過高是將來小孢子高頻再生體系中需要進(jìn)一步解決的問題。

表1 大麥小孢子高頻再生體系的優(yōu)化

表2 我國(guó)大麥栽培不同生態(tài)區(qū)4份代表品種的游離小孢子培養(yǎng)結(jié)果

針對(duì)青藏高原裸大麥區(qū)的青稞作物，也是小孢子培養(yǎng)中遲鈍基因型材料，陸瑞菊等已在國(guó)際上首次報(bào)道了青稞的小孢子再生成苗技術(shù)[7]，目前正在開展高頻再生體系優(yōu)化工作。

2 小孢子高頻再生技術(shù)在大麥青稞育種中的應(yīng)用

自2009年起，筆者利用建立的小孢子高頻再生技術(shù)，結(jié)合在此基礎(chǔ)上發(fā)展形成的小孢子高鹽、低氮、赤霉病菌毒素脅迫培養(yǎng)篩選等新方法，連續(xù)為湖北、甘肅、黑龍江、內(nèi)蒙、青海等地的大麥青稞育種團(tuán)隊(duì)提供育種材料的小孢子培養(yǎng)公益服務(wù)，截止2017年底已培養(yǎng)育種材料528份，獲得再生植株12萬(wàn)多株（表3）。近5年來每年都有上萬(wàn)份小孢子再生苗移栽云南昆明基地，成活率達(dá)90%以上，再生植株結(jié)實(shí)率達(dá)90%以上。各育種團(tuán)隊(duì)獲得小孢子培養(yǎng)形成的加倍單倍體株系后，在當(dāng)?shù)亻_展鑒定性試驗(yàn)和品比試驗(yàn)，快速形成了一批優(yōu)良大麥青稞新品系和品種（表4、表5），極大地提高了我國(guó)大麥青稞主產(chǎn)區(qū)的育種效率。

在建立大麥小孢子高頻再生技術(shù)的基礎(chǔ)上，近年來還發(fā)展了3項(xiàng)遺傳改良的新方法，目前已取得初步應(yīng)用效果：1）不經(jīng)種子的單株小孢子高效培養(yǎng)技術(shù)（專利申請(qǐng)?zhí)枺?01510890842.3）。利用小孢子培養(yǎng)高頻再生基因型大麥花30品種，不僅實(shí)現(xiàn)了當(dāng)代單株來源小孢子高頻再生[8]，而且實(shí)現(xiàn)了不經(jīng)種子階段的再生植株小孢子高頻再生，這一技術(shù)目前已用于大麥花30與西藏野生大麥遠(yuǎn)緣雜交胚挽救形成的F1小孢子培養(yǎng)，為野生種質(zhì)材料外源基因滲入栽培種的難題提供了新的解決途徑。2）基于小孢子高頻再生體系的轉(zhuǎn)基因方法（專利申請(qǐng)?zhí)枺?01611011357.5）。利用農(nóng)桿菌直接侵染游離培養(yǎng)小孢子，成功將目標(biāo)基因BAK03316轉(zhuǎn)入大麥品種“花30”中，轉(zhuǎn)化效率約為17%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前期用基因槍轟擊花藥轉(zhuǎn)化小孢子的頻率[16]；利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)MLO基因 (白粉病廣譜抗性基因)在小孢子水平進(jìn)行編輯，獲得的大麥花30（高感白粉?。┬℃咦釉偕仓陮?duì)接種白粉病表現(xiàn)出高抗，目前正在進(jìn)行基因編輯效率研究。3)單倍體群體構(gòu)建方法（專利申請(qǐng)?zhí)枺?01410710796.X）。利用小孢子培養(yǎng)中獲得的單倍體植株，采用基部分蘗節(jié)誘導(dǎo)叢生芽的方法成功獲得大量單倍體再生植株[14]，繼代5次后鑒定仍然保持單倍體倍性，建立了單倍體無(wú)性繁殖的穩(wěn)定群體[15]，解決了單倍體種質(zhì)保存與常年利用的難題，目前已從保存單倍體植株中制備獲得了葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體，并正在開展轉(zhuǎn)基因和基因編輯研究。

3 展望

小孢子培養(yǎng)技術(shù)提供了一個(gè)單倍體生殖細(xì)胞離體培養(yǎng)再生系統(tǒng)，相比傳統(tǒng)花藥培養(yǎng)更高效。有研究報(bào)道大麥中小孢子培養(yǎng)再生綠苗相比花藥培養(yǎng)平均提高9.3倍[17]，表明小孢子培養(yǎng)技術(shù)在綠苗高頻再生方面比花藥培養(yǎng)技術(shù)更有潛力。盡管國(guó)內(nèi)外已有大麥小孢子培養(yǎng)方法優(yōu)化的系列報(bào)道，但要將小孢子培養(yǎng)技術(shù)真正用于育種，首先要針對(duì)生產(chǎn)上大量使用的育種材料優(yōu)化小孢子培養(yǎng)方法，突破基因型障礙；其次要建立一套高頻再生綠苗程序，獲得大量小孢子再生植株；最后，還需要建立一套高效的加倍單倍體形成方法。筆者所在團(tuán)隊(duì)已通過技術(shù)研發(fā)建立了上述一整套小孢子高頻再生技術(shù)體系，并用于大麥青稞的規(guī)?；N，實(shí)現(xiàn)了在1～2年內(nèi)從1個(gè)優(yōu)良雜交組合獲得上百份永久純合的加倍單倍體，可供育種家開展多年、多目標(biāo)性狀的篩選鑒定，大大加速了育種進(jìn)程，提高了常規(guī)育種效率，顯示出了巨大的應(yīng)用潛力。

突破大麥小孢子高頻再生技術(shù)瓶頸，經(jīng)單個(gè)培

養(yǎng)皿培養(yǎng)就可以獲得上百株再生植株，在此基礎(chǔ)上還可發(fā)展單倍體細(xì)胞水平的誘變、脅迫篩選、轉(zhuǎn)基因、基因編輯以及原生質(zhì)體融合等多種技術(shù)手段[18]。筆者所在團(tuán)隊(duì)早期利用小孢子培養(yǎng)中加入高鹽、低氮、赤霉病菌毒素等非生物脅迫處理，結(jié)合誘變或雜交手段獲得的加倍單倍體株系中成功篩選到了一批耐鹽性、耐低氮性和抗病性提高的突變體材料[19-22]，初步顯示了誘變、雜交等傳統(tǒng)育種手段與小孢子脅迫培養(yǎng)結(jié)合形成的細(xì)胞工程復(fù)合育種技術(shù)的應(yīng)用潛力。近年來，基于小孢子高效培養(yǎng)體系拓展的不經(jīng)種子階段的單株小孢子連續(xù)培養(yǎng)、單倍體群體構(gòu)建與單倍體材料的轉(zhuǎn)基因、基因編輯以及原生質(zhì)體培養(yǎng)等技術(shù)也取得了一定進(jìn)展，且正在進(jìn)一步優(yōu)化中。這些技術(shù)的研發(fā)將在麥類作物遺傳改良的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究方面發(fā)揮重要作用，同時(shí)也為水稻、小麥等重要禾谷類作物的遺傳改良提供有益借鑒。

表3 不同來源大麥青稞材料的小孢子培養(yǎng)再生綠苗頻率

表4 利用小孢子育種技術(shù)選育的大麥青稞新品系

表5 利用小孢子育種技術(shù)選育的大麥青稞新品種

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