響應面法優(yōu)化三白草總黃酮的微波提取工藝

馮海燕，孫偉晗，劉佳旺

（石家莊學院 化工學院，河北 石家莊 050035）

0 引言

三白草別稱塘邊藕、水木通，多年生草本植物，主要分布于河北、河南、山東和長江流域及其以南各地，具有清熱解毒、利水消腫之功效，可用于治療尿路感染、尿路結石、腎炎水腫、皮膚濕疹和疔瘡等[1].研究表明，黃酮類化合物是三白草的主要活性成分之一，具有保肝抗炎、降低血糖的作用[2]，因此三白草總黃酮的提取具有重要意義.汪怡等[3]和馮海燕等[4]分別對三白草總黃酮的熱回流提取工藝和超聲提取工藝進行了研究和優(yōu)化，采用的均為正交設計試驗.

響應曲面法（RSM）是一種優(yōu)化多變量系統(tǒng)的有效實驗工具[5].它通過擬合響應值和各因素的相互關系，在一定的優(yōu)化區(qū)域內能以簡單、高效的方式找到各因素最佳水平的組合，克服了正交設計試驗只能處理孤立實驗點的不足[6].在單因素試驗的基礎上，采用響應曲面分析法對三白草總黃酮的微波提取工藝進行了優(yōu)化，旨在為三白草的進一步開發(fā)利用提供技術支持和參考.

1 實驗部分

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料

蘆?。ㄅ枺?00080-200707，中國藥品生物制品檢定所），無水乙醇、三氯化鋁、冰醋酸、醋酸鈉均為分析純.

三白草購于河北省安國市旭芳中藥材經營有限公司，經石家莊學院化工學院生藥教研室岳紅坤副教授鑒定為真品.

1.1.2 儀器

MCR-3常壓微波化學反應器（鞏義市予華儀器有限公司），TU-1950雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），F(xiàn)W-100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）.

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

精密稱取蘆丁5.6 mg，置于小燒杯中，用無水乙醇溶解，定量轉移至50 mL容量瓶中，并用無水乙醇定容，即得蘆丁對照品溶液.分別量取蘆丁對照品溶液0.0，1.0，2.0，2.5，3.5，5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加無水乙醇至8 mL，依次加入0.1 mol/L AlCl3溶液3 mL，pH=4.5的HAc-NaAc緩沖溶液5 mL，再加水定容，混合均勻后靜置15 min，用紫外分光光度計測定溶液在406 nm處的吸光度.以濃度C（μg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，進行線性回歸.工作曲線為：A=0.0358 2+0.0322 7C，r=0.999 3，說明線性關系良好.

1.2.2 三白草的預處理

將三白草用粉碎機粉碎，按1 g三白草：6 mL石油醚（60～90℃）的比例加入石油醚，熱回流6 h，脫脂、脫色.減壓過濾后將三白草粉末置于干燥箱中，60℃烘干8 h，待用.

1.2.3 供試品溶液的制備

準確稱取1.0 g三白草粉末，按某一液料比加入某一體積分數(shù)的乙醇溶液，在一定的微波功率下微波提取一定時間.提取液減壓抽濾，定容，即得供試品溶液.

1.2.4 總黃酮含量的測定

精密量取4 mL供試品溶液，轉移至25 mL容量瓶中，按1.2.1節(jié)的方法，測定溶液在406 nm處的吸光度，根據(jù)工作曲線計算三白草中總黃酮的含量.

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 精密度實驗

對同一供試品溶液，平行量取5份，每份4mL，分別按1.2.1節(jié)所述方法測定吸光度，吸光度的相對標準偏差（RSD）為0.81%.

1.2.5.2 重復性實驗

準確稱取1.0 g三白草5份，在相同的實驗條件下微波提取，過濾，定容，測定.總黃酮的含量分別為13.00，12.96，13.18，13.36，12.78 mg/g，平均含量為 13.06 mg/g，RSD 為 1.70%（n=5），說明所建方法重現(xiàn)性良好.

1.2.5.3 加標回收率實驗

精密量取3份已測定含量的供試品溶液1.0 mL，分別加0.8，1.1，1.4 mL蘆丁對照品溶液，按照1.2.1節(jié)的方法測定溶液的吸光度，計算回收率.平均回收率為100.3%，說明方法的準確度較高.

1.2.6 試驗設計

選擇乙醇體積分數(shù)、提取時間、微波功率和液料比作為研究因素，進行單因素試驗.在此試驗基礎上，選取3個對三白草總黃酮提取效果影響較大的因素，進行三因素三水平的響應曲面分析，對提取條件進行優(yōu)化.

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

實驗考察了4個選定因素對三白草總黃酮提取效果的影響，結果如圖1～圖4所示.可以看出，隨液料比的增大，三白草總黃酮的提取量明顯增加，當液料比超出40 mL/g以后，再增加溶劑用量，總黃酮提取量基本趨于穩(wěn)定（圖1）.其他3個因素對三白草總黃酮提取量的影響呈現(xiàn)相同的變化，均隨這3個因素的增加，提取量先增后減（圖2～圖4），其中微波功率對提取效果的影響較不明顯（圖4）.

圖1 液料比的影響

圖2 提取時間的影響

圖3 乙醇體積分數(shù)的影響

圖4 微波功率的影響

2.2 響應面法優(yōu)化試驗

2.2.1 分析方案及結果

由于微波功率的變化對總黃酮提取量的影響較小，試驗中將其固定在480 W，選擇乙醇體積分數(shù)、提取時間、液料比3個因素進行三因素三水平的Box-Behnken響應曲面設計試驗，具體的因素水平見表1，試驗設計及結果見表2.

表1 響應面分析因素及水平

表2 響應曲面的分析方案及試驗結果

2.2.2 回歸方程與方差分析

采用Design Expert 8.0.6軟件對表2中的17組實驗數(shù)據(jù)進行分析，擬合得到三白草總黃酮含量（Y）對乙醇體積分數(shù)（A）、液料比（B）和提取時間（C）的回歸方程：Y=+12.19+0.093A-0.088B+0.066C-0.097AB+0.32AC-0.18BC-0.21A2-0.43B2-0.13C2，方差分析結果如表3所示.

表3 二次回歸模型的方差分析

由表3可知，回歸模型達極顯著水平（P=0.000 1），失擬項不顯著（P=0.110 9），決定系數(shù)=0.939 1，說明回歸模型對試驗擬合較好，可用于三白草總黃酮提取過程的分析和預測.各因素對總黃酮提取率影響的主次順序為A（乙醇體積分數(shù)）＞B（液料比）＞C（提取時間）.A、B、C2對提取過程有顯著影響，交互項AC、BC和二次項A2、B2有極顯著影響，說明3個因素對響應值的影響不是簡單的線性關系.

2.2.3 響應面分析

根據(jù)回歸方程，可以得出乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間中任意兩個因素對三白草黃酮提取率影響的響應面圖，結果見圖5.

由圖5（a）知，總黃酮提取率隨乙醇體積分數(shù)或液料比的增加均呈先增后降的變化，即這兩個因素取值過大過小，都不利于三白草黃酮的溶出.

圖5（b）表明，當提取時間一定時，隨乙醇體積分數(shù)的增加，黃酮提取率先升后降，說明三白草黃酮具有一定的極性[7]；當乙醇體積分數(shù)在50%～65%之間時，提取時間增加，黃酮提取率先升后降，乙醇體積分數(shù)在65%～70%之間時，黃酮提取率隨時間的延長逐漸升高.

圖5（c）反映的是當乙醇體積分數(shù)為60%時，液料比和提取時間對總黃酮提取率的影響.固定液料比或提取時間，總黃酮提取率均隨著另一因素的增加呈先增后降的變化.

響應曲面平面投影的形狀可反映出交互作用的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[8].圖5（b）和圖5（c）中投影呈橢圓，說明提取時間和液料比之間、提取時間和乙醇體積分數(shù)之間交互影響顯著，這與表3的數(shù)據(jù)相一致.

圖5 各因素交互作用對三白草總黃酮提取率影響的響應面圖

2.2.4 驗證試驗

回歸模型得出的最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)70%，液料比45.67 mL/g，提取時間8 min.此條件下得到的響應值為12.40 mg/g.為操作方便，將液料比修正為46 mL/g，微波功率仍固定在480 W.按最佳工藝條件，平行試驗3次，三白草總黃酮的實際提取率為12.33 mg/g，與預測值基本吻合.

2.3 對比試驗

本試驗采用文獻報道的熱回流法[3]和超聲波法[4]對同一批三白草進行了總黃酮的提取，試驗結果列于表4.由表4可以看出，超聲波法的總黃酮提取率明顯低于另外兩種方法，熱回流法的黃酮提取率略高于微波法，但微波法的提取時間僅為熱回流法的三十分之一.綜合評價，微波法不失為提取三白草黃酮的一種最優(yōu)的提取工藝.

3 結論

在單因素試驗結果的基礎之上，采用響應曲面試驗設計，對中草藥三白草中的活性成分總黃酮的微波提取工藝進行了優(yōu)化，得到的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)70%，液料比46 mL/g，提取時間8 min，微波功率480 W，此條件下黃酮的提取率可達12.33 mg/g.該研究為三白草總黃酮的進一步開發(fā)利用提供了實驗數(shù)據(jù)和參考.

表4 不同提取方法黃酮提取率的比較

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2]肖偉，彭偉，彭勇，等.三白草的研究進展[J].中草藥，2010，41（12）：2111-2115.

[3]汪怡，李祥，邱蓉麗，等.三白草中總黃酮醇提工藝的研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2007，25（4）：812-813.

[4]馮海燕，劉閃，張云霄，等.三白草總黃酮的超聲波提取工藝研究[J].安徽農業(yè)科學，2010，38（15）：7863-7865.

[5]REDDY L V,WEE Y J,RYU H M,et al.Optimization of Alkaline Protease Production by Batch Culture of Bacillus sp.RKY3 Through Plackett-burmanandResponseSurfaceMethodologicalApproaches[J].BioresourceTechnology,2008,99（7）:2242-2249.

[6]王振忠，武文潔.野菊花總黃酮提取工藝的響應面設計優(yōu)化[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18（3）：648-650.

[7]朱家校，何偉，李勇，等.響應面分析法優(yōu)化川芎藁本內酯提取工藝的研究[J].中成藥，2011，33（12）：2172-2175.

[8]李小菊，張越非，鐘玲，等.響應曲面法優(yōu)化微波輔助提取魔芋葡甘露聚糖的工藝研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24（3）：525-529.