參茸益精片對高原缺氧腦損傷中Caspase分子的影響*

霍 堅 ，王海偉 ，王自勤，蘇 丹，呂宏迪△

1解放軍第一五九醫(yī)院，河南 駐馬店 463000；2河南省武警總隊醫(yī)院

高原急性缺氧易引起腦損傷，對當?shù)鼐用竦纳眢w健康危害嚴重，但其發(fā)生的分子機制復(fù)雜，影響因素眾多［1-3］。闡明高原急性缺氧引起腦損傷的分子機制，探尋有效的臨床治療靶點和預(yù)防治療方案，是目前本領(lǐng)域國內(nèi)外研究的熱點。參茸益精片主要由西洋參、黃芪等藥物藥組成，具有復(fù)脈固脫，補脾益肝，生津養(yǎng)血，安神益智壯腎陽，益精血，強筋骨等功能，可用于丙肝、乙肝常規(guī)治療后以及腫瘤患者放化療后白細胞減少，血紅蛋白低，高原反應(yīng)及消化不良等癥［4-6］。但參茸益精片對于高原缺氧造成的腦損傷是否具有保護作用，其具體分子機制如何，目前尚未見相關(guān)報道。本實驗以大鼠高原缺氧腦損傷動物模型為研究對象，通過Western blot和RT-PCR等實驗，觀察Caspase-3和Caspase-9蛋白和mRNA表達的變化，分析并闡明參茸益精片腦損傷保護作用的分子機制，為其臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 模型建立 SD大鼠18只，體質(zhì)量(180～200g)，由解放軍一五九醫(yī)院實驗動物中心提供，動物實驗合格證號：DWZX2016032，隨機分為空白對照組，模型組對照組和參茸益精片治療組，每組均為6只，通過低壓氧艙建立高原缺氧動物模型?？瞻讓φ战M大鼠給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)(由動物中心提供，總熱量為11.2KJ/g)，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境維持在25℃溫度和50%濕度，明暗周期12小時/12小時；通過低壓氧艙建立高原缺氧動物模型后，模型組對照組大鼠在上述飼養(yǎng)環(huán)境中，給予常規(guī)飼料并自由飲水，而治療組動物在給予上述處理的同時，口服灌胃參茸益精片0.5mg/kg。8周后，檢測各組大鼠腦部相關(guān)指標變化。

1.2 Caspase-9和Caspase-3活性檢測 取大鼠腦組織，PBS沖洗，按Caspase活性檢測試劑盒操作程序，加入裂解液，機械勻漿處理，1500 r/min離心20分鐘，取上清，加入Ac-LEHD-pNA，室溫放置1小時，測定吸光度值(405 nm)。

1.3 Western blot分析Caspase-3和Caspase-9表達 取大鼠腦組織，PBS沖洗，加入裂解液，機械勻漿處理，離心30分鐘，12 000 r/min。BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%奶粉孵育1小時，封閉非特異性背景染色，再分別加入Caspase-3和Caspase-9一抗(1∶1000)孵育，4℃過夜后，與二抗室溫孵育2小時。ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，收集圖像，Caspase-3和Caspase-9抗體均購自美國Abcam公司。

1.4 RT-PCR分析Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達 分別取大鼠肝臟和主動脈組織，Tzail法提 取 總 RNA，通 過 RT-PCR分 析 Caspase-3和Caspase-9mRNA水平的變化。Tzail試劑購自美國invitrogen公司。Caspase-3上游引物：5′-CAGACAGTGGAACTGACGAT-3′，下 游 引 物 ：5′-TTTCAGCATGGCGCAAAGTG-3′；Caspase-9 上游引物 5′-CAGTGGGCTCACTCTGAAGACC-3′，下 游 引 物5′-ACGCGTTACTGGCATTGAGG-3′；β-actin 上游引物：5′-GAAGTGTGACGTTGACAT CCG-3′，β-actin 下游引物:5′-GCCTAGAAGCATTTGCGGTG-3′，引物由上海碧云天生物技術(shù)公司設(shè)計。瓊脂糖凝膠(1%)電泳分離RT-PCR產(chǎn)物(Bio-Rad公司電泳儀)，凝膠成像儀觀察圖像，分析組間差異。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，各組間差異采用t檢驗比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 參茸益精片對Caspase-3和Caspase-9活性的影響 高原缺氧造成腦損傷后，與空白對照組相比較，大鼠腦組織中大鼠肝臟中Caspase-3和Caspase-9活性顯著增加(P＜0.05)。參茸益精片治療組的動物，與模型組相比，Caspase-3和Caspase-9活性均顯著降低(P＜0.05)。見表1。

表1 參茸益精片對Caspase-3和Caspase-9活性的影響

2.2 參茸益精片對Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達的影響 與空白對照組相比較，模型組動物腦組織中Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達均明顯增加(P＜0.05)；參茸益精片治療組的動物，與模型組相比，腦組織中Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達顯著降低(P＜0.05)。見圖1。

圖1 參茸益精片對Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達的影響

2.3 參茸益精片對高原缺氧腦損傷大鼠Caspase-3和Caspase-9表達的影響 模型組大鼠，與空白對照組相比較，腦組織中Caspase-3和Caspase-9表達顯著增加(P＜0.05)，而經(jīng)過參茸益精片治療的動物，與模型組相比，腦組織中Caspase-3和Caspase-9表達顯著降低(P＜0.05)。見圖2。

圖2 參茸益精片對Caspase-3和Caspase-9表達的影響

3 討論

參茸益精片的主要有效成分是人參皂苷(Ginsenoside)Rg1、Re 和黃芪甲苷(Astragaloside A)，具有復(fù)脈固脫，補脾益肝，生津養(yǎng)血的功效，可以達到疏通脈管，改善臟器供血，調(diào)節(jié)人體代謝功能的目的［7-8］。高原急性缺氧易引起腦損傷，在高原地區(qū)的臨床發(fā)病率持續(xù)增高，其發(fā)生的分子機制復(fù)雜，影響因素眾多。分析并闡明參茸益精片保護高原急性缺氧引起的大鼠腦損傷的分子機制，將為其臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本研究中，我們通過建立大鼠高原急性缺氧模型，觀察參茸益精片對缺氧大腦的保護作用，以闡明參茸益精片的作用機制，為其進一步的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3和Caspase-9與大鼠高原急性缺氧造成的腦損傷密切相關(guān)，與空白對照組相比較，高原急性缺氧模型大鼠腦組織中Caspase-3和Caspase-9表達均明顯增加，參茸益精片治療組的動物，與模型組相比，Caspase-3和Caspase-9表達均顯著降低。通過RT-PCR實驗，上述分子的mRNA表達水平也體現(xiàn)一樣的趨勢。以上結(jié)果提示，參茸益精片具有顯著的腦保護作用，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

綜上所述，參茸益精片能夠顯著高原急性缺氧模型大鼠腦組織相關(guān)分子的表達，可能作為臨床治療并預(yù)防急性缺氧腦損傷的藥物。

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