大鼠皮下注射重組日本七鰓鰻毒素肽rLj-RGD3的血漿藥代動力學研究

王玉平，韓國柱，武國宇，于 萍，呂 莉*，王繼紅

(1.遼寧師范大學生命科學學院,遼寧 大連 116029；2.大連醫(yī)科大學藥理教研室，遼寧 大連 116044，大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院藥學部,遼寧 大連 116000)

rLj-RGD3是源于日本七鰓鰻口腔腺，通過基因工程技術獲得的由118個氨基酸組成、分子量為1.35×105的含有3個RGD模體的重組日本七鰓鰻毒素肽[1]。研究發(fā)現(xiàn)，rLj-RGD3憑借其RGD模體與活化的血小板內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞及新生血管內(nèi)皮細胞表面高表達的整合素(integrin)靶向結(jié)合，而具有抑制血小板聚集、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移及抗血管新生等典型的RGD毒素蛋白功能[2-6]，但其藥代動力學方面的研究少見報道。本研究采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)，研究皮下注射rLj-RGD3在大鼠體內(nèi)的血漿藥代動力學，為其新藥研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

rLj-RGD3粉針劑，20 mg/瓶，HPLC測定純度>97%，批號20160807，由遼寧師范大學提供；ELISA試劑盒，批號08032016，南京，金斯瑞生物科技公司產(chǎn)品。

MODEL550型酶標儀，美國BIORAD公司產(chǎn)品。3P97藥代動力學計算軟件，中國藥理學會數(shù)學專業(yè)委員會研制。

SD大鼠，雄性，(200±20)g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗動物質(zhì)量合格證號SCXK(遼)2002-0002，實驗動物使用許可證號SYXK(遼)2002-0005。喂標準飼料，自由飲水。

1.2 標準曲線的制備

取大鼠空白血漿，以樣品稀釋液稀釋1000倍獲得血漿樣品稀釋液。用此血漿樣品稀釋液稀釋rLj-RGD3標準品(0.95 g/L)，配制1 mg/L rLj-RGD3標準母液，再以血漿樣品稀釋液倍比稀釋標準母液至rLj-RGD3終濃度為1600、800、400、200、100、50、0 μg/L的生物樣品標準溶液，以制備生物樣品標準曲線。

1.3 動物實驗處理

取SD大鼠15只，按給藥劑量隨機分為3組(n=5)，置于標準條件自由飲水進食適應3 d后，皮下注射rLj-RGD3，劑量為30、75、150 μg/kg，自由飲水。于給藥前及給藥后5、10、15、30、45、60、90、120、150、180、240及300 min自大鼠眼內(nèi)眥靜脈取血13次，每次0.2 mL，采用3.8%枸櫞酸鈉(體積比9∶1)抗凝，3000 r/min離心10 min獲得血漿，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ脮r室溫溶解并以樣品稀釋液10～1000倍適當稀釋，采用ELISA法檢測各血漿樣品中rLj-RGD3血藥濃度C(C=Cd×N，C為血藥濃度，Cd為稀釋后的藥物濃度，N為稀釋倍數(shù))，繪制平均血漿藥物濃度-時間曲線，并采用3P97軟件擬合房室模型及計算藥代參數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 標準曲線

取標準溶液及血漿標準溶液同時進行ELISA法測定，重復5次，以OD值為縱坐標，濃度C為橫坐標，進行線性回歸，制備絕對標準曲線和血漿標準曲線，結(jié)果見圖1A。絕對標準曲線及血漿標準曲線回歸方程分別為y=0.001 4x+0.028 7，R=0.996 0及y=0.001 1x+0.032 8，R=0.999 0。

2.2 大鼠皮下注射不同劑量rLj-RGD3后血漿藥-時曲線

按照1.3項下方法進行大鼠血漿藥動學的研究，ELISA法測定的OD值，經(jīng)隨行標準曲線計算血藥濃度，繪制平均血藥濃度(C)-時間(T)曲線如圖1B，將血藥濃度用3P97軟件計算出相應藥代動力學參數(shù)見表1。

表 1 rLj-RGD3在大鼠血漿中的藥動學參數(shù)

注:T1/2ka吸收半衰期,T1/2α分布半衰期,T1/2β消除半衰期,V/Fc表觀分布濃度,AUC藥時曲線下面積,CLs血漿總清除率,Tpeak最高血藥峰時間,Cmax藥峰濃度

3 討 論

目前對蛋白多肽類藥物藥代動力學的研究常采用同位素標記法、免疫測定法及生物測定法等方法進行藥物濃度的測定[7]。其中免疫測定法包括放射免疫測定法、免疫放射定量法、ELISA等。而ELISA法因具有檢測快速、靈敏度高、特異性好、選擇性強等優(yōu)點，首選用于蛋白多肽類藥物的檢測。本研究即是采用了ELISA法研究rLj-RGD3的藥代動力學。

本研究結(jié)果表明，皮下注射3種劑量rLj-RGD3后，吸收迅速，達峰時間26 min左右，不隨劑量改變而發(fā)生顯著變化。3P97程序擬合房室模型符合二室模型。在30、75、150 μg/kg下，Cmax分別為(1.45±0.21)、(3.68±0.25)、(7.86±0.47)μg/mL；T1/2β、CLs不隨劑量的改變而發(fā)生顯著改變；AUC與劑量成正比。提示，皮下注射rLj-RGD3在30～150 μg/kg劑量范圍內(nèi)，呈線性藥代動力學。

研究結(jié)果可知，SC rLj-RGD3的T1/2ka為10 min左右，說明皮下給藥吸收很快。但皮下注射后藥物的半衰期時間卻長達85 min左右(P>0.05)，其可能的原因是皮下注射后藥物進入血液需要一段時間，使得藥物在體內(nèi)分布達到平衡狀態(tài)后血漿藥物濃度降低一半所需要的時間，即半衰期較長。

綜上，大鼠皮下注射rLj-RGD3吸收迅速，其血漿藥代動力學參數(shù)顯示為線性動力學。

參考文獻：

[1] XIAO R,PANG Y,LI Q W.The buccal gland of Lampetra japonica is a source of diverse bioactive proteins[J].Biochimie,2012,94(5):1075-1079.

[2] WANG J H,HAN X X,YANG H,et al.A novel RGD-toxin protein,Lj-RGD3,from the buccal gland secretion of Lampetra japonica,impacts diverse biological activities[J].Biochimie,2010,92(10):1387-1396.

[3] 王繼紅,于鳳,韓曉曦,等.日本七鰓鰻富含半胱氨酸RGD蛋白Lj-RGD1抑制血小板聚集及抗血管新生功能[J].中國生物化學與分子生物學報,2012,28(6):531-537.

[4] 王繼紅,張亞前,呂莉,等.日本七鰓鰻Arg-Gly-Asp毒素蛋白Lj-RGD3野生型與RGD全缺失突變體Lj-112的抗血管新生作用[J].生物工程學報,2011,27(10):1428-1437.

[5] 張丕橋,王繼紅,劉欣,等.重組七鰓鰻細胞毒素蛋白rLj-RGD3表達及對Hela細胞活性的影響[J].生物工程學報,2009,25(5):686-694.

[6] YEH C H,PENG H C,YANG R S,et al.Rhodostomin,a snake venom disintegrin,inhibits angiogenesis elicited by basic fibroblast growth factor and suppresses tumor growth by a selective αvβ3blockade of endothelial cells[J].Mol Pharmacol,2001,59(5):1333-1342.

[7] 韓國柱,何巍,任開環(huán).蛋白多肽類藥物的藥動學特點及其影響因素[J].醫(yī)藥導報,2003,22(1):9-11.